污水中新冠病毒富集浓缩和核酸检测方法来了！

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污水中新冠病毒富集浓缩和核酸检测方法来了！

检测家

2022.4.27

近日，《WST799—2022 污水中新型冠状病毒富集浓缩和核酸检测方法标准》正式发布实施。

#在公众号回复【799】即可下载标准全文

本标准由国家卫生健康委环境健康标准专业委员会负责技术审查和技术咨询，中国疾病预防控制中心卫生标准处负责协调性和格式审查，国家卫生健康委员会疾控局负责业务管理、法规司负责统筹管理。

本标准起草单位：

中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、清华大学、中国科学院生态环境研究中心、中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所。

本标准主要起草人：

张岚、唐宋、黄霞、杨敏、张晓、张良、王园媛、刘艳臣、田哲、段招军。

范围

本标准规定了污水中新型冠状病毒富集浓缩和核酸检测方法。

本标准适用于生活污水、医疗机构污水中新型冠状病毒富集浓缩和核酸检测。

检出限

富集浓缩采用聚乙二醇沉淀法或铝盐混凝沉淀法时，方法检出限为10 copies/mL；富集浓缩采用离心超滤法时，方法检出限为100 copies/mL。

水样的采集、运输及保存

根据采样场所排水系统分布情况，重点选取污水排水口、内部管网汇集处等关键位置对未经消杀处理的污水进行采样。用无菌聚乙烯瓶采集污水样本，采样体积为300 mL。可根据现场条件和检测需求确定水样采集方式，如瞬时水样（采样点位某一时间随机采集的样本）或混合水样（同一采样点位不同时间所采集的瞬时水样混合后的样本）。

样本采集后应在现场使用75%酒精对采样瓶外表面进行消毒，然后将采样瓶装入密封采样袋中，对密封采样袋外表面再次进行消毒，并尽快将样本送至实验室，运输过程中确保0 ℃～4 ℃条件下冷藏运输。

到达实验室后样本同样应保存于0 ℃～4 ℃环境中，实验室应在接到样本后24 h内进行富集浓缩处理，并在富集浓缩后24 h内完成核酸提取及实时荧光反转录聚合酶链式反应（实时荧光RT-PCR）检测。

病毒灭活

将样本充分混匀后置于60 ℃水浴30 min。

注：水浴锅水位应高于样本液面，确保容器内样本达到目标温度。

病毒富集浓缩

注：本部分中三种新型冠状病毒富集浓缩方法适用条件相同，使用过程中可根据实验条件进行选择。

聚乙二醇沉淀法

原理

向污水中加入聚乙二醇，聚乙二醇在一定盐浓度条件下可使病毒颗粒形成多聚体，在一定离心力下将水溶液与病毒颗粒多聚体分开，收集病毒颗粒多聚体形成的沉淀，用于后续核酸提取和实时荧光RT-PCR检测。

试剂和材料

试剂

聚乙二醇：分子生物学级，平均分子量 8000

氯化钠：分子生物学级

无核酸酶水：分子生物学级

材料

无菌带盖离心管：1.5 mL，无核酸酶；50 mL 或 250 mL，可承受离心力≥12000 g

无菌移液器吸头：1 mL，带滤芯，无核酸酶

无菌移液管：50 mL

仪器设备

高速冷冻离心机：4 ℃，50 mL 或 250 mL 转子，可承受离心力≥12000 g

电子天平：分辨力不低于 0.001 g

生物安全柜：II 级或 II 级以上

高压灭菌器

移液器：1 mL

大容量电动移液器

富集浓缩步骤

预离心

用大容量电动移液器分别移取3份35 mL污水样本置于3个50 mL离心管中，在4 ℃、2 500 g条件下离心30 min，将上清液分别转移到另外3个50 mL离心管中备用。剩余污水样本作为备份。

注1：当污水样本悬浮物含量过高，可能影响病毒核酸提取和实时荧光RT-PCR检测时，应采用预离心弃除悬浮物后再进行后续操作。

注2：若选用250 mL离心管，可直接取105 mL污水样本于250 mL离心管中，在上述条件下离心后将上清液转移到另外1个250 mL离心管中备用。

第二次离心

在3个装有35 mL污水样本或预离心后上清液的50 mL离心管中分别加入3.5 g±0.1 g聚乙二醇和0.79 g±0.01 g氯化钠，充分混合，直至试剂完全溶解，该溶解过程约需15 min。然后在4 ℃、12 000 g条件下离心120 min，离心机降速时不应使用制动力。离心机停止后倾倒并弃除离心管中的上清液，至无上清液流出。

注：若选用250 mL离心管，在装有105 mL污水样本或预离心后上清液的250 mL离心管中操作时，聚乙二醇和氯化钠用量应等比例增加，其他操作相同。