产品测评与应用！4D label free磷酸化/4D-DIA磷酸化助力更精准的高深度磷酸化蛋白质组学研究

蛋白是生命活动的直接执行者，但蛋白并不是在翻译后就能够直接行使功能的，大多数的蛋白往往需要进行翻译后修饰。目前已发现的蛋白翻译后修饰类型有300多种，其中蛋白磷酸化（Phosphorylation）是最广泛的一种蛋白翻译后修饰。

在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰。在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸酶。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动

Letpub数据显示2021年国家自然基金批准的磷酸化研究突破了300项，总资助金额超过1.4亿。磷酸化修饰对于癌症、神经退行性疾病、免疫疾病、药理、毒理机制研究等领域具有重要的研究意义，为识别关键磷酸化事件、关键信号通路和调控机制提供了一个独特的视角，有助于发现疾病靶点和生物标志物，辅助疾病的诊断与治疗。

近年来蛋白质组学技术的发展和应用为磷酸化蛋白质的定性、定量和功能研究提供了必要的技术，使大规模和系统性进行磷酸化蛋白质研究成为可能。但磷酸化蛋白质技术仍面临一些技术挑战：

磷酸化蛋白含量少，化学计量值低，磷酸化肽段很容易淹没在大量非磷酸化肽段中。受限于仪器分析灵敏度，只有当磷酸化肽段富集后才能使磷酸化肽段检测变得相对容易。同时也需要更高的质谱扫描速度和灵敏度来鉴定到低丰度的磷酸化肽段。

两个同分异构体的磷酸化肽段，分子序列完全一样，只是发生磷酸化修饰的位置不同。面对这样微小的差别，传统蛋白组学质谱平台不能对这些共洗脱的同分异构肽段进行分离，从而可能会导致出现错误定位的问题。

同一蛋白在不同样本中能否重复检测到？同一样本重复检测，定量值是否一致？这是任何一项生物学研究都需要面对的问题。

离子淌度的引入，把蛋白质组学带入的4D 蛋白质组学时代。基于timsTOF Pro/Pro2平台建立的4D磷酸化蛋白质组，为实现磷酸化定量蛋白组分析带来了更优秀的解决方案。

4D平台引入的离子淌度分离能根据肽段的离子迁移速度，将修饰位点定位相近的同分异构多肽有效区分，提高位点定位可靠度。因此，4D修饰组学带来的更精确位点定位，为后续位点验证及功能实验提供更可靠基础。

4D仪器平台有效区分同分异构单磷酸化肽

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测试数据表明，200 µg hela细胞，90分钟4D label free磷酸化和4D-DIA磷酸化检测，均能实验高深度磷酸化鉴定。相比传统label free磷酸化检测技术，4D label free磷酸化检测能力提升60%，4D-DIA磷酸化检测能力甚至提高了1.2倍！

相比4D label free技术（DDA技术），4D-DIA磷酸化蛋白质组学为全景式扫描，数据缺失值少，鉴定与定量结果的可重复性更高，数据可回溯。测试结果表明，4D-DIA磷酸化的三次技术重复性达85%，定量相关性在0.9以上。

DDA定量相关性 vs DIA定量相关性

磷酸化蛋白质组技术存在不同技术路线，每种技术有其技术优势，可根据样本数量以及对数据质量的要求进行综合选择，例如样本数≥30例，就可以考虑用4D-DIA磷酸化蛋白质组技术。各类技术特点如下：