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【知识分享】高效液相（HPLC）色谱柱10大误解（上）

纳谱分析

2022.7.15

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在任何领域，通常都存在着“误解”，这些误解或一直延续到下一代，这些误解通常是由于从业人员对实际问题缺乏了解而引起的。本期为您揭开高效液相（HPLC）色谱柱10个最流行的误解的神秘面纱。

误解1

HPLC色谱柱不能反转使用

假。实际上，高效液相色谱（HPLC）色谱柱的填充压力要比其最大操作压力高得多（通常是其两倍）。因此，如果使用适当的溶剂并分配了稳定填充床所需的时间，则填充良好的色谱柱应该能够在两个方向上工作。人们可能想使色谱柱沿相反方向流动的一些原因包括：在色谱柱切换中进行反吹操作，用顽固强力吸附的样品冲洗色谱柱的入口。冲洗捕获的颗粒以减少压力积聚。

反相HPLC色谱柱的里也有例外。如果制造商在色谱柱入口处使用了较高孔隙率的玻璃料，则可以通过反转色谱柱将颗粒从填充床中冲洗掉。在工厂装填色谱柱时，在色谱柱出口处的筛板孔隙率必须低于色谱柱的最小粒径。纳谱分析色谱柱出口入口使用相同的筛板，可以正向使用，反向冲洗；如果色谱柱填料粒径为5 μm，一般选用2 μm的筛板，如果色谱柱填料粒径小于等于3 μm，一般选用0.5 μm的筛板，这样就不会有填料逸出。

某些制造商为何在色谱柱的入口和出口处有不同的孔隙度？简单。较高孔隙度的筛板比较低孔隙度的筛板具有更少的堵塞趋势。0.5 μm的筛板比2 μm的筛板堵塞更快。因此，为防止压力迅速增加和客户抱怨，制造商可能在入口处使用宽容度更大的多孔筛板。通常，该色谱柱将用箭头标记，指示仅应在一个方向上使用它。

备注：反转HPLC色谱柱之前，最好查阅色谱柱说明书或与色谱柱制造商联系，以查看色谱柱是否可以反转。色谱柱反方向冲洗之前，一定要将色谱柱返接，不连接检测器冲洗一段时间。以防有杂质将流通池堵住。一般情况下，正常色谱柱反方向冲洗后应保持反方向使用。

误解2

所有C18（L1）色谱柱都相同

假。在HPLC的早期，十八烷基硅烷（最常被称为ODS或C18相）是最早可用于称为“反相色谱”的新技术的键合固定相之一。它成为了反相色谱的标准相，并被大多数从业者迅速采用。由于制药业是HPLC的较早采用者，并且监管机构不想加持特定制造商的色谱柱品牌，因此，美国食品药品管理局（FDA）和美国药典（USP）开发了一种分类系统，该分类系统为在新药申请下提交的每种新方法。对于HPLC色谱柱，给定了“ L”标记，并且由于大多数提交物中都使用了C18，因此它变为“ L1”。随着添加附加相，它们被赋予了自己的“ L”编号（例如，L7 C8，L10 CN，L11苯基等）。

不幸的是，该指定系统被证明是不可靠的，因为使用硅胶作为基础材料，每个C18色谱柱的合成方法都不相同，并且所得反相色谱柱具有不同的性能。例如，纳谱分析ChromCore AQ C18色谱柱采用特殊键合和封端工艺，具备适度的硅胶表面覆盖率和疏水性，是一款能耐100%水相的反相色谱柱；ChromCore AR C18色谱柱采用粒径高度均一的高纯硅胶微球，先进成熟的表面键合，无封尾处理，可在低pH条件下免受水解的作用，避免因封尾试剂在酸性条件下易水解而改变C18选择性的问题，使其在酸性流动相条件下具有更出色的分离性能、稳定性和更长的使用寿命；ChromCore BR C18色谱柱基于在单分散硅胶微球，先对表面硅胶层进行有机杂化处理，再多点键合十八烷基和完全封端处理，兼容强碱性和强酸性条件；而ChromCore 120 C18-T色谱柱是一款十八烷基键合硅胶色谱柱，采用单分散硅胶微球基球，多点键合，完全封端，具备更强的化学稳定性和更高的立体选择性。这些C18色谱柱均被认为是“ L1”（详情参见下图1）。

图1 纳谱分析不同型号的C18色谱柱

误解3

保护柱不影响分离效果

假。首先，有一个保护柱是个好主意。但是，如果选择了错误的配置或固定相，保护柱的选择会对分离产生很大影响。请记住，保护柱的目的是保护分析柱免受高度保留的样品组分，微粒和其他不良物质的污染。保护柱比它保护的分析柱便宜得多。因此，它可以更频繁地更换，而不是更换更昂贵的分析柱。

理想情况下，选择的保护柱应具有与分析柱完全相同的固定相。如果该相更具保留性（例如，具有更大的碳载量或为混合模式相），则它可能通过引起保留时间偏移甚至选择性差异而以有害的方式影响分离。如果该固定相的保持力较弱，则可能会或可能不会引起问题，除非所选的固定相影响了整体选择性。

为了使保护柱对分离性能的影响最小，必须将保护柱正确地插入流路中。显然，保护柱插入在进样器和分析柱之间，但是如果使用过多的连接管（过长或两个内径较大），则会发生柱外带扩展，从而影响整体分离。采用集成保护柱的系统会提供最佳解决方案，其中保护柱实际上与分析柱对接。但是，集成式保护柱通常与盒式色谱柱系统相关联，这似乎已受到人们的青睐。无论采用哪种配置，保护柱都应能够轻松卸下并从HPLC系统中更换，而不会影响其操作。

从理论上讲，如果保护柱在分析柱上增加了额外的柱长，则应该产生额外的塔板，从而增加色谱分离度。但是，由于前面讨论的一些因素，通常添加保护柱不会使分离效果保持最佳状态，有时甚至会降低分离效果。保护柱的优点是延长了色谱柱的使用寿命，并不一定增加总效率。

纳谱分析

保护柱及柱芯

图2 纳谱分析保护柱系列产品（含卡套、柱芯）

误解4

提高温度往往有利于分离效果

假。随着温度升高，流动相的粘度降低，因此，溶质传质的速率应增加，从而提供更好的色谱效率。的确如此，但是除了色谱柱效率项（H）之外，温度还会影响保留因子（k）和选择性（α）。对这些术语的影响会导致分辨率提高（这是色谱分析中我们真正关心的问题）或有损分辨率。保留时间通常随温度升高而降低，因为作为热力学参数，分析物更喜欢保留在流动相中，并从色谱柱中更快地洗脱出来。但是，不同的化学物种其保留度随温度变化的程度可能不同，它们的α值可以改变。另外，高温会导致低k峰被迅速洗脱，以至于它可以在t0或接近t0时洗脱，即未保留的峰保留时间，因此难以量化。

以图3为例，该系列色谱图显示了在20–90 °C的柱温下七种止痛药的分离。可以注意到色谱图的几个特征。首先，随着温度的升高，所有峰的保留降低，并且峰的确变窄，表明效率提高。其次，相对于最接近的洗脱化合物峰5和6，一种止痛化合物水杨酸随温度的保留变化更大。实际上，将温度从20 °C升高到40 °C后，洗脱顺序颠倒了。在30 °C的中间温度下，水杨酸和峰号6，非那西丁被共洗脱。因此，在这种情况下，高于40 °C的温度会使整个分离过程的分离时间缩短，但洗脱顺序却开始发生变化。

图3

20–90 °C的柱温下七种止痛药的分离

当然，在提高温度下操作的另一个好处是降低了色谱柱的工作压力，使操作人员可以使用更高的流速或更小的粒径的填料。

另一个在高温下能够导致色谱柱性能问题的因素是流动相的温差。如果柱子在60°C下操作，但是流动相在室温流入，那么进入的较冷的流动相就能够引起峰变形，原因是不同温度下分析物会趋向在高温的流动相中。所以建议大家在较高温度下使用色谱柱的时一定记得预热流动相。

误解5

碳载量越高，反相色谱柱就越好

假。谈到普通的烷基键合相时，这样的结论看来是对链长、载碳量和表面键合度等概念有误解。通常，对一个真正的反相保留机制来说，保留能力取决于被分析分子的相对疏水性，所以保留一般取决于载碳量。载碳量越高，保留能力越强。载碳量一般与链长成正比，但并不是必然如此。

典型的色谱硅胶表面，可用于和有机硅烷试剂键合反应的硅醇含量在8.0 μmol/m²左右。假设在所有的硅醇基上都能实现单层键合，则链长越长，载碳量就越大，结果是保留能力与链长成正比。短链键合相（比如C8），如果表面键合度相对更高，那么键合的碳就会更多，就会导致可能比C18有更加强的保留能力。

此外，一些厂家使用二氯硅烷和三氯硅烷做键合试剂，由于聚合反应的发生通常能增加固定相的键合率。这种情况下，短链聚合键合相会比长链单体键合相的键合度高很多。对比单体键合相，聚合物键合相的键合层较厚，有时会引起传质速度变慢。高载碳量的反相柱更加容易发生相塌陷。对于这些色谱柱，当流动相中有机相比例降到10%以下的时候，疏水固定相之间就会倾向于互相结合（self-associate），而不是处于在极性水溶液中的溶解状态（即相似相溶）。所以，高碳载量反而可能对反相色谱性能有害，而且保留时间的重现性也不好。

由于篇幅过长，本期分享分为上下两篇，下期内容，敬请期待，谢谢关注~

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