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Stem Cell Res Ther | 单细胞转录组测序助力解析hUCB-MSCs治疗宫腔粘连疾病机制研究

创新多组学技术服务

2022.8.01

前言

2022年7月15日，郑州大学附属郑州中心医院妇产科王雅莉教授团队及干细胞再生实验室张辉教授团队于Stem Cell Research & Therapy( IF 8.079 )发表了hUCB-MSCs治疗宫腔粘连单细胞测序的最新研究成果。

作者利用新西兰大白兔作为实验动物，通过机械损伤和感染方法建立IUA模型，随后进行hUCB-MSCs移植治疗。通过对兔IUA模型移植hUCB-MSCs治疗后的子宫内膜样本进行单细胞测序分析，发现hUCB-MSCs注射后可以分化为子宫内膜细胞，这将有助于了解间充质干细胞移植治疗子宫内膜损伤的机制和临床治疗。

欧易生物提供了该项目的单细胞转录组测序实验和分析工作。

基本信息

期刊：Stem Cell Research & Therapy

影响因子：8.079

发表年月：2022年7月

材料：新西兰大白兔IUA经hUCB-MSCs移植治疗后的样本（n=1）

方法：10x Genomics高通量单细胞转录组测序

研究目的

子宫内膜是播种生命的“土壤”。然而，子宫内膜损伤和宫腔粘连会让这片“土壤”变得贫瘠，从而导致不孕症。宫腔粘连（Intrauterine Adhesions，IUA）又称Asheman综合征，是由于各种原因导致的子宫内膜损伤，引起宫腔纤维化粘连，使宫腔部分或全部闭塞。目前，IUA治疗的金标准是宫腔镜下切除粘连，术后辅以雌激素治疗以刺激子宫内膜的再生。这种治疗策略对轻度或中度疾病患者有效，但对严重IUA患者效果不佳。

近年来，干细胞治疗对缓解子宫内膜功能障碍性疾病具有很好的应用前景。宫腔粘连患者经过粘连松解手术后，将植入临床级脐带间充质干细胞（ MSCs ）的可降解胶原支架移植到宫腔内，MSCs有助于促进子宫内膜修复和受损组织再生。虽然MSCs在IUA治疗中是一种很有前途的细胞治疗方法，但这些研究仍处于实验研究阶段，其确切的治疗机制值得进一步研究。

为了探究hUCB-MSCs治疗IUA的优势，作者利用兔作为实验动物，通过机械损伤及感染方法建立IUA模型，随后分别进行雌激素和hUCB-MSCs移植治疗。与雌激素治疗组相比，hUCB-MSCs治疗组术后恢复程度更接近于正常组。作者为探讨其潜在的治疗机制，首次利用scRNA-seq对 IUA模型hUCB-MSCs治疗后子宫内膜样本进行分析，研究发现hUCB-MSCs注射后可以分化为子宫内膜细胞，这将有助于了解间充质干细胞移植治疗子宫内膜损伤的机制和临床治疗。

研究结果

Result1 hUCB‑MSCs鉴定及其特征描述

首先对人间充质干细胞（hUCB-MSCs）进行镜检，可以看到细胞贴壁且呈成纤维细胞样形状。

经过初步质量控制，最终保留59913个细胞，其中有30968个细胞来自正常宫颈，有10944个细胞来自正HSIL，有11660个细胞来自正宫颈，剩余6341个细胞来淋巴结转移灶。随后利用t-SNE降维聚类，根据细胞基因表达值将其化为9个不同的簇（T/NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、B细胞、内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞）。

hUCB-MSCs 细胞呈CD73、CD90、CD105阳性，以及CD34、CD45、CD11b、CD19和HLA-DR阴性。流式结果显示，这些结果符合人间充质干细胞（hUCB-MSCs）的特征。

Result2 hUCB-MSCs移植后子宫内膜腺体数量和纤维化率

利用兔作为实验动物，使用机械损伤子宫内膜直至粗糙感，术后放置脂多糖棉线，建立IUA模型。

IUA造模后处理：一组为雌激素（estradiol benzoate）注射治疗组，另一组为hUCB-MSCs注射治疗组。

根据HE染色和Masson染色结果，正常子宫内膜表面由高柱状上皮细胞组成，子宫内膜腺体主要位于粘膜下层和基底层。与正常组相比，造模组（14/28天）腺体数量明显减少，纤维化率明显升高。与术后14天相比，术后第28天的情况没有改善，这表明兔IUA模型成功建立。与IUA造模术后28天相比，hUCB-MSCs治疗后子宫内膜腺体数量显著增加，纤维化率显著下降。雌激素治疗组与IUA模型组术后28天相比，可以观察到存在子宫内膜腺数量增加和纤维化率下降的趋势，但无显著性差异。与雌激素治疗组相比，hUCB-MSCs治疗组的两项指标更接近于对照组，这表明hUCB-MSCs在IUA治疗中的明显优势。

Result3 hUCB-MSCs治疗后子宫内膜ER、Ki-67和TGF-β1的表达

为了探讨hUCB-MSCs对IUA子宫内膜的作用，作者进一步检测了ER、Ki-67和TGF-β1在子宫内膜组织中的表达，分别反映激素水平、血管生成能力和子宫组织纤维化程度。hUCB-MSCs治疗后，与造模后28天相比，ER和Ki-67表达明显增加，TGF-β1表达明显减少。值得注意的是，与造模术后28天相比，雌激素治疗组的ER表达增加，TGF-β1表达减少，而Ki-67表达无显著差异。此外，与雌激素治疗组相比，hUCB-MSCs治疗组中ER、Ki-67和TGF-β1的表达更接近于对照组。因此，hUCB-MSCs在IUA治疗中优于雌激素。

Result4 ScRNA-seq显示hUCB-MSCs可以分化为子宫内膜细胞

作者为了从单细胞水平上研究IUA的细胞组成结构以及细胞分化轨迹，利用hUCB-MSCs移植治疗后的兔IUA子宫内膜样本进行scRNA-seq以及后续生物信息学分析。

考虑到利用hUCB-MSC治疗家兔IUA样本，作者将测序的结果分别比对到人和家兔参考基因组中。经过质控后，作者得到人源性细胞4097个，经过t-SNE降维聚类后共获得8个细胞簇。根据细胞基因表达以及基因功能富集分析，鉴定了四种主要细胞类型，包括间充质干细胞（MSCs）、成纤维细胞（Fibroblasts）、上皮细胞（Epithelial cells）和巨噬细胞（Macrophages）。MSCs是hUCB-MSCs注射治疗后的残余细胞，其余三种细胞类型（ Fibroblasts 、 Epithelial cells和Macrophages）可能是hUCB-MSCs注射治疗后子宫内膜重建的结果，由于hUCB-MSCs表现出干细胞样特征，并有可能分化为其他细胞类型，因此作者推测hUCB-MSCs分化为Fibroblasts 、 Epithelial cells和Macrophages，并重建子宫内膜结构。

为了验证这一猜想，作者利用Monocle进行拟时分析，结果表明， hUCB-MSCs有分化成为Fibroblasts 、 Epithelial cells和Macrophages的趋势，这种由hUCB-MSCs分化成子宫内膜组织的特征，将有助于了解间充质干细胞注射治疗子宫内膜损伤的机制以及临床治疗。

同样作者得到兔源细胞8792个，经过t-SNE降维聚类以及亚群鉴定，共获得四种主要细胞类型（内皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞、巨噬细胞）以及三种罕见的细胞类型。

将人源细胞数据与兔源细胞数据合并比较，作者观察到内皮细胞和成纤维细胞的比例升高，而上皮细胞和巨噬细胞的比例降低。通过与先前研究中正常子宫组织细胞百分比进行比对分析，作者发现与单独兔源细胞类型相比，合并后细胞类型的分布更类似于正常子宫内膜组织细胞的比例。提示间充质干细胞可以分化为子宫内膜组织细胞，使受损的子宫内膜环境恢复正常，这反映了间充质干细胞注射在IUA治疗中的价值。随着hUCB-MSCs注射后作用时间的延长和机体自我修复的启动，受损子宫内膜组织中的细胞比例可能越来越趋于正常。

Result5 RNA测序显示hUCB-MSCs在治疗IUA中调节Th17/Treg平衡和NF-κB信号转导

为了阐明hUCB-MSCs治疗在IUA中的作用机制，作者对兔IUA模型组（n=3）以及hUCB-MSCs治疗组（n=3）样本进行bulk RNA-seq，从而观察hUCB-MSCs注射治疗前后IUA样本中的分子表达变化。结果表明hUCB-MSCs注射治疗后导致2188个基因上调，1193个基因下调。基于这些差异表达的基因进行GO和KEGG途径富集分析。GO结果表明，差异表达的基因主要在细胞增殖和细胞迁移相关功能中富集。KEGG分析表明，hUCB-MSCs注射治疗可能参与免疫细胞（T1、T2和T17）分化、T细胞受体信号通路调节和NF-κB信号通路调节有关的途径。

据报道，NF-κB信号通路可能参与hUCB-MSCs注射治疗IUA，因此作者重点关注NF-κB的表达。通过bulk RNA-Seq、qRT-PCR、Western Blot分析证实，与治疗前（兔IUA模型组）相比， NF-κB基因与蛋白水平均有所降低，表明NF-κB信号可能在hUCB-MSCs调节子宫内膜微环境中发挥关键作用。文献研究表明，间充质干细胞可以调节Naïve型T细胞向Treg型细胞的转化，并降低Th17/Treg细胞的比例以发挥免疫调节功能，上述过程可以通过激活NF-κB信号通路进行调节。因此，作者认为hUCB-MSCs在治疗IUA中调节了T17/Treg平衡以及参与NF-κB信号传导，这也促进了hUCB-MSCs注射治疗IUA的机制理解和临床应用。

文章总结

这项研究探讨了hUCB-MSCs治疗IUA的潜在机制，作者首次采用scRNA-seq对IUA模型组以及hUCB-MSCs治疗组样本进行分析，发现hUCB-MSCs注射后可以分化为子宫内膜细胞（成纤维细胞、上皮细胞和巨噬细胞）。此外作者还发现，hUCB-MSCs治疗IUA过程中可能参与免疫细胞（T1、T2和T17）分化、T细胞受体信号调节以及NF-κB信号通路平衡等过程，这将有助于了解间充质干细胞移植治疗子宫内膜损伤的机制以及临床治疗。此项研究证明，hUCB-MSCs可能是一种很有前途的IUA治疗方法，然而对于IUA患者的长期安全性和有效性还需要更多的研究。

DOI: 10.1186/s13287-022-02990-1

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