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为什么重组C因子可以代替鲎试剂用于内毒素检测?

上海玮驰仪器有限公司
2022.8.18

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着技术的进步,内毒素检测方法也从最初的兔热原检测法(RPT)发展到鲎试剂检测法(LAL/TAL),再到如今的重组因子C(rFc)法,经历了从体内到体外,从少量到通量,从缓慢到快速的逐步发展更替,来不断满足行业发展的需求。


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图1内毒素检测方法发展史


近年来,重组C因子内毒素检测法以其快速、简单、非动物源等特点受到越来越多的关注,有望替代鲎试剂,成为内毒素检测的主要方法。我们将从4个方面论述了这一替代趋势的必然性:


  • 从原理角度看,LAL和rFC都能用于内毒素检测

  • 重组生物技术的发展必然带来检测方法的革新

  • 对rFc检测法在应用中所面临的阻力的深度理解

  • 对rFC法接受度的逐步增长及法规和监管状态加持


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图2rFC重组因子检测法应用的四大支柱

1)LAL既定效用;2)重组技术的发展;3)对面临阻力的深度理解;4)接受度的逐步增长


从工作原理上看,LAL和rFC都能用于内毒素检测

从原理上看,rFC方法的发明是基于对鲎试剂法内毒素检测的级联反应的通路理解。生物化学家表征了鲎凝血级联中的蛋白质成分,系其血细胞和变形细胞中的一系列丝氨酸蛋白酶(C因子、B因子、G因子和凝固酶原、凝固蛋白原)[1-2],这些丝氨酸蛋白酶负责在内毒素存在时的鲎血液凝固(图3),为行业内从凝胶法检测发展到动态浊度法、动态显色法,之后发展到rFC方法提供了科学依据。同时,标准品CSE/RSE和国际标准的建立也为包括rFC方法的定量检测打好了良好基础。


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图3鲎试剂内毒素检测原理


重组生物技术的发展必然带来检测方法的革新

自1982年,礼来公司生产出了第一个商业化重组人胰岛素Humulin®以来,越来越多的治疗性大分子被开发,也给生物技术行业带来了一股新的力量。多年来,科学家一直在试图生产出一种可持续、环保、经济的人工合成内毒素识别因子,保护鲎资源。


随着对凝血级联酶的认知不断积累,科学家们对内毒素极其敏感的丝氨酸蛋白酶因子C进行了基因工程改造。从开始了解C因子的生化性质,到使用分子生物学技术进行克隆,并在各种宿主(细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞)中表达全功能重组因子C蛋白,历经了15年[3-5],最终确定重组C因子(rFC)的多功能结构域,使其成为一种具有酶活性的前体,识别和结合内毒素后表现出催化活性。


rFc法只需一步即可酶切荧光底物产生荧光,并根据底物酶切的量来反馈内毒素含量,完全符合实验动物的3R原则:减少,替换,优化,以及第四个“R”原则,即内毒素检测的重现性。因此,采用rFC代替LAL的优势是显而易见的。


对rFc检测法在应用中所面临阻力的深度理解

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图4内毒素检测方法及原理

rFC是单组分,单步骤敏感特异的内毒素检测方法


在生物医药领域,药品和诊断产品受到高度监管,采用可靠的LAL内毒素检测替代方法,例如rFc方法,对水、原材料和过程样品的测试都非常重要,因为替代方法的使用可以大约节约90%的鲎试剂使用。近半个世纪以来,尽管LAL检测也存在一些问题,制药公司和医疗保健行业仍在很大程度上依赖于LAL,直到2004年,rFC方法才商业化。


但是,从RPT到LAL,从LAL到rFC,内毒素检测方法的更替都是基于行业发展的需求,纵观历史,都需要一定的时间,需要行业的反复论证和实践检验。


迄今为止,rFC检测方法认可度也算是在逐渐提高,也是一种久经考验的LAL检测补充或替代方法。不仅仅具有“3S”优势Scientific characterization(可靠)、Sensitivity(灵敏)和Specificity(特异),还具有易于被大规模、批量、自动化生产,批间一致性有保障,不受G因子旁路干扰等特点,更有利于制药公司获得准确、可靠检测结果。


rFC的未来之路–法规和监管状态(美国、欧盟、中国)

多年来,科学家们一直设想将鲎的先天免疫研究结果应用于生物技术、制药和人类保健行业。C因子和许多其他进化保守的分子已被确定为在免疫防御、抗菌作用和治疗败血症方面具有实用性,LAL也应该重点用于拯救生命和提高生活质量的分子研究[6-7]。基于rFC的内毒素检测的应用已在全球范围内得到研究应用的支持,缓解了洁净技术中对鲎的需求。礼来公司采用rFC 进行药物质量控制,其中四个已成功获得FDA的认可,证明了rFC用于注射药物安全性检测的可靠性和价值[8-9]


从资源可及性角度看,鲎的持续捕捞也非常不明智,它会给整个医药产品供应链带来风险。很多科学家也在努力促进使用合成rFC代替LAL,以保护鲎免于灭绝,加速了rFC作为药典试验的采用。随着制药行业发展,越来越多法规许可rFC作为LAL方法的替代方法(表1)。目前有超过100家新冠疫苗生产公司在使用rFC方法用于质控,以实现高效的过程生产和质量保证。


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原文链接:

https://www.americanpharmaceuticalreview.com/Featured-Articles/569617-Endotoxin-Detection-The-Four-Pillars-of-rFC-Adoption-in-Lieu-of-LAL/


Lonza是第一家被授权生产rFC因子的厂商,其中PyroGene重组因子试剂盒已被多家药企使用。一项全球、多中心研究显示,使用PyroGene从水和其它测试产品中回收内毒素与基于LAL的方法相当。试剂盒验证的结果发表在药典论坛36[1]卷(2010年1月-2月)。


自1970年至今半个世纪以来,Lonza作为较早期开发内毒素检测产品的公司,为全球客户提供包括细菌内毒素检测试剂盒、内毒素检测软件、内毒素检测酶标仪在内的一站式解决方案,符合FDA21CFR part 11和欧盟EUGMP附录11法规要求,已用于国外大量药物的放行上市,满足出口型/双报制药企业的规模化内毒素测定需求。


Lonza内毒素产品

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参考文献:

(可上下滑动)

1.Nakamura S, Morita T, Iwanaga S. Biochemical characterization of protein components associated with hemolymph coagulation system of limulus (Tachypleus tridentalus). Thrombosis and Haemostasis. 1983;50: 405.

2.Iwanaga S, Morita T, Miyata T, Nakamura T. Hemolymph coagulation system in Limulus. In: L. Leive et al. ed. Microbiology, American Soc. Microbiology. Washington. 1985:pp.29-32.

3.Ding JL, Navas MAA III, Ho B. Molecular cloning and sequence analysis of Factor C cDNA from the Singapore horseshoe crab, Carcinoscorpius rotundicauda. Molecular Marine Biol and Biotechnol. 1995;4(1):90-103.

4.Pui AWM, Ho B, Ding JL. Yeast recombinant Factor C from horseshoe crab binds endotoxin and causes bacteriostasis. J Endotoxin Res. 1997;4:391–400.

5.Wang J, Ho B, Ding JL. Functional expression of full length Limulus Factor C in stably transformed Sf9 cells. Biotechnol Lett. 2001;23:71–76.

6.Zhu Y, Ng PM, Wang L, Ho B, Ding JL. Diversity in lectins enables immune recognition and differentiation of wide spectrum of pathogens. Int Immunol. 2006;18(12):1671–1680

7.Jiang N, Thangamani S, Chor CF, Wang SY, Winarsih I, Du RJ, Sivaraman S, Ho B, Ding JL. A novel serine protease inhibitor acts as an immunomodulatory switch while maintaining homeostasis. J. Innate Immunity 2009;1:465-479.

8.Williams KL. Cleanroom Technology,“Recombinant Factor C assay to aid demand for LAL endotoxin testing” 9 March 2020. 

9.Bolden J, Smith K. Application of recombinant Factor C reagent for the detection of bacterial endotoxins in pharmaceutical products. PDA J. Pharm Sci Technol 2017;71(5):405-412 

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