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Nature Communiations: 峰值力轻敲模式高分辨率原子力显微镜成像——多粘菌素的抗菌机制

布鲁克纳米表面仪器

2022.12.22

布鲁克期刊俱乐部第81期 Bruker Journal Club

布鲁克纳米表面仪器郭鑫博士

内容简介

多粘菌素被称作“最后一道防线”抗生素，其对多重耐药性病原体具有强大作用。多粘菌素可与细菌膜上的脂多糖（LPS，lipopolysaccharide）进行相互作用，但其在分子水平上的机制细节仍不清楚。作者DanielJ.Müller, Sebastian Hiller等于2022年10月在《Nature Communication》发表题为“Antibiotic polymyxin arranges lipopolysaccharide into crystalline structures to solidify the bacterial membrane”的文章。作者通过高分辨率原子力显微镜成像以及结构和生物化学检测，来描述多粘菌素与大肠杆菌外膜斑块的相互作用。作者发现多粘菌素可以将LPS排列成六边形结晶结构。此结晶结构的形成与抗生素的活性相关，并且不存在于多粘菌素耐药性菌株。晶格参数会随着LPS和多粘菌素分子结构的变化而改变。原子力显微镜的定量测量表明，结晶结构减少了膜的厚度，增加了膜的面积和硬度。这些发现共同表明，刚性LPS-多粘菌素晶体的形成和随后的膜破裂是多粘菌素抗菌的作用机制。这为将来优化和重新设计针对LPS的抗菌剂提供了一个标准。

研究方法与理论基础

多粘菌素是从一种叫做多粘菌（Paenibacillus polymyxa）的革兰氏阳性细菌次级代谢物中生物合成而来的。多粘菌素E（大肠杆菌素）和多粘菌素B是研究和使用最多的两个变种。关于它们的作用机制，人们普遍认为多粘菌素通过其阳离子L-α-γ-二氨基丁酸侧链（diaminobutyric acid，Dab）和第6和第7位残基的疏水相互作用与脂多糖（LPS，lipopolysaccharide）分子相互作用而发挥作用。LPS在细菌内膜（IM，inner membrane）中合成，然后通过特定的运输途径运输到外膜（OM，outer membrane）。LPS分子的紧密包裹是由二价阳离子Mg²⁺和Ca²⁺诱导的，它们与带负电的脂质A分子相互作用。多粘菌素与LPS在内膜和外膜都有相互作用。这种相互作用导致细菌外膜的力学性能改变，造成细菌表面明显的隆起和渗透性的改变。之后，多粘菌素进入内膜，再次与LPS分子相互作用，最终杀死细菌。然而，LPS和多粘菌素之间相互作用的直接机制仍然不清楚。有人认为膜渗透性的改变可能是由多粘菌素的脂肪酰基尾巴以类似表面活性剂的作用原理导致的。但最近的实验对此提出质疑，因为多粘菌素在血清中的浓度不足以产生这种机制，而且多粘菌素对LPS有特异性作用。由于多粘菌素的最低抑制浓度（minimal inhibitory concentrations ，MICs）特别低，这使得结构特异性的机制更有可能。原子力显微镜（Atomic force microscope，AFM）是一种强大的纳米级测量仪器，可以在从细胞到膜甚至单分子水平进行测量。与其他需要特殊样品制备或在非生理状态下操作的纤维成像技术不同，AFM可用于在生理相关的液体环境中成像。此外，AFM能够通过其力曲线模式同时对细胞、膜和分子的机械性能进行成像和量化。因此，AFM不仅可以监测样品结构变化，同时可以记录细菌膜的力学性能。

实验结果与讨论

作者利用革兰氏阴性大肠杆菌的外膜囊泡（outer membrane vesicles， OMVs）形成含有LPS的生物膜。外膜囊泡被吸附在原子平坦的云母表面上，形成直径范围为100-300纳米的平展生物膜。在用多粘菌素培养之前和之后，用原子力显微镜记录生物膜的形貌。作者发现用1mg/L的多粘菌素处理OM后，行程了具有规则的六边形晶格的结晶结构的形成（图1a）。这些二维结构的单元格长度为10nm，从膜表面突出的高度1-1.2nm。它们的形成了长程有序结构，可以在膜上观察到相当大的结晶阵列。这些结构可以在几个小时内保持稳定。有序结构的形成表明其在多粘菌素E与外膜发生了相互作用。为了验证这一猜想，作者首先研究了多粘菌素E与抗菌活性的联系。通过监测大肠杆菌生长曲线来测量随着多粘菌素E浓度增加而改变的最小抑制浓度（MIC）（图1b）。在增加多粘菌素E的浓度的同时进行AFM成像，并观察到在与MIC相匹配的浓度下开始形成结晶结构（图1c）。这一现象强化了结晶结构参与多粘菌素作用机制的假设。然后，作者对AFM图像进行了傅里叶变换分析。具有六边形对称性的衍射图案，表明存在长程有序结构（图1c）。接下来，作者研究了具有多粘菌素耐药性菌株的外膜囊泡。其中耐药性是由于膜表面的化学修饰降低了膜的净负电荷，从而降低了脂质A与带正电多粘菌素之间的静电作用。实验表面具有耐药菌的大肠杆菌MG1655，能够在比野生型菌株高得多的多粘菌素E浓度下生长（图1b）。当使用原子力显微镜对从耐药菌制备的生物膜进行成像时，即使在多粘菌素E浓度高达600mg/L，也没有自组装超分子结构（图1d）。对AFM图像进行傅里叶变换分析也没有产生明显的斑点模式，这证实了这些样品中没有结晶结构（图1d）。总的来说，耐药菌中没有结晶结构，进一步加强了结晶结构与多粘菌素E的抗菌活性之间的关系。

建基于抗体的病毒-二茂铁复合物

为了确定LPS对结晶结构形成的必要性，作者用大肠杆菌极性脂质制作了无LPS的脂质双层膜。用60mg/L的多粘菌素E孵化后，这些膜中没有形成结晶结构。为了检查蛋白质的必要性，作者从大肠杆菌中培养了不含外膜蛋白的膜。在多粘菌素E培养后，这些不含膜蛋白的双层膜形成了类似的超分子结构，这表明结晶结构的形成与外膜蛋白含量无关。这些观察结果共同表明，六边形结晶结构的形成需要LPS，但不依赖于特定的膜蛋白。之后，作者又研究了二价阳离子Ca²⁺和Mg²⁺的作用。它们通过静电作用与外膜的LPS分子之间连接。在高浓度的Mg²⁺（5mM）溶液中也可以形成结晶结构，多粘菌素E的浓度会略微升高到1.2mg/L。这表明结晶结构与外膜中LPS的自然结构存在竞争关系。与此同时，二价阳离子对结晶结构的形成至关重要，用阳离子螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA）处理后，结晶结构被完全破坏。同样地，用EDTA预孵化的外膜也无法形成结晶结构。这些现象表明，二价阳离子与LPS，多粘菌素E一起参与形成了结晶结构。

为了建立分子结构与抗菌活性的关系，作者在LPS和多粘菌素E中都引入了分子结构变化，并表征了其对结晶结构的影响（图2）。为了研究LPS的影响，作者合成了具有不同长度LPS的菌膜。尽管其形貌各有不同（图2a），但是在这四种菌株的外膜中都观察到了超分子结构。每一种LPS都在外膜上形成了六方晶格。通对高分辨率AFM图像进行定量分析后，得到确定晶格常数分别为9.8±1.7 nm、9.8±3.9 nm、9.4±2.7 nm和7.3±3.7 nm（图2b）。晶体结构的晶格常数随着LPS长度的降低而降低，证实了LPS参与了晶体结构。除了横向的变化外，作者还观察到晶体结构高度的明显变化。最短的LPS的形成了最短的突起结构。此结构也不存在长程有序的六边形结构。相反，对于含有LPS的外核和扩展成分的菌株，晶体结构仍然具有长程有序性。

除了改变LPS外，作者也对多粘菌素的结构（图3a）进行了改变。多粘菌素的10个氨基酸残基中有6个是阳性的Dab残基，在生理条件pH值下带有正电。位于七肽环的Dab残基与脂质A的磷酸基团的静电相互作用特别重要。除了七肽环残基外，之前的研究表明N端脂肪酰基链对多粘菌素的抗菌活性和毒性至关重要。因此，作者在多肽环和尾部引入化学修饰来研究对晶体结构的影响。在环状残基修饰的情况下，带有D-Thr10残基的多粘菌素E类似物在外膜上形成了结晶结构。相反，当Dab9被改变为叠氮基，从而减少了整体电荷时，没有形成结晶结构（图3b）。

为了研究多粘菌素骨架长度对结晶结构影响，作者使用了多粘菌素E的三种衍生物。一个是全长的多粘菌素E，一个是缺乏N端脂肪酰基链的中间变体（Intermediate-length Polymyxin E），还有一个是多粘菌素E非肽（polymyxin E nonapeptide, PMEN。同时缺乏N端脂肪酰基链和阳离子Dab1残基）（图3c）。用这三种多粘菌素E衍生物处理外膜后的AFM图像显示，全长和中间变体诱导了结晶结构的形成，而非肽变体PMEN则没有。之后作者还研究了多粘菌素B的全长和非肽变体（PMB和PMBN），它们都能诱导外膜形成结晶结构（图3d）。

为了更清楚地了解情况，作者系统地测定了七个不同的多粘菌素变体与五个不同的大肠杆菌菌株的MIC值，并与结晶结构形貌进行了比较（图4）。这组数据表明，结晶结构的形成与多粘菌素E和多粘菌素B所有变体的活性完全一致。此外，MIC值总是与诱导结晶结构形成时所需的多粘菌素浓度接近。唯一的例外是多粘菌素B非肽（PMBN），尽管其抗菌活性低，但似乎形成了结晶结构。因此可以得出结论，结晶结构对于多粘菌素的杀菌活性是必要的。PMBN的特殊行为有可能被D-Phe6残基的关键作用所解释，在PMB中，D-Phe6残基为驱动多粘菌素的疏水部分向膜方向移动的关键因素。很可能在没有脂质N端尾巴的情况下，同样的相互作用可以促进PMBN的晶体形成。总的来说，尽管有这种特殊性，但MIC值和晶体结构形成之间的相关性是明显的，并且与已知的带正电荷的残基和N端脂肪酸尾部对多粘菌素的杀菌活性的完全一致。

接下来，作者描述了多粘菌素对外膜生物物理特性的影响（图5）。多粘菌素E处理后，膜的表面积增加，膜的高度（厚度）降低（图5a）。作者监测了四种化合物多粘菌素E（PME）、PMEN、PMB和PMBN在浓度增加（0、0.1、0.3、0.6、6、60mg/l）时的变化（图5b、c）。加入PME、PMB、PMBN后，外膜上形成了结晶结构。这三种化合物的膜面积和高度的变化总体上相似。值得注意的是，膜性质随浓度的变化以非线性方式发生。但在结晶浓度下主要表现为单一步骤反应。与此形成鲜明对比的是，PMEN的膜面积和高度的变化要小得多，这与它不能在外膜上形成结晶结构一致。

接下来，作者测量了多粘菌素引起的膜的力学性质。作者使用了峰值力轻敲Peak Force Tapping模式扫描用多粘菌素E培养的外膜定量地得出其弹性模量和力学性质变化。数据显示，在结晶结构形成的同时，外膜的弹性模量明显增加（图6a）。相反，抗菌性外膜的弹性模量，在与多粘菌素E孵化后显示出轻微但不明显的下降（图6b）。通过AFM成像测量多粘菌素E浓度增加对外膜的模量和型变量的影响，作者发现结晶结构使弹性模量大约增加了一倍，其型变量减少了约20%。

总结

在这篇文章中，作者使用峰值力轻敲原子力显微镜技术将生物样品的分辨率提高到了纳米级，可以测出多粘菌素在细菌膜中与LPS形成有序的六边形结晶结构。无论是多粘菌素的浓度依赖性还是活性都与结晶结构的形成直接相关。这些观察结果表明，六边形晶体是多粘菌素作用机制的一部分。六边形晶体由LPS、多粘菌素和二价阳离子组成。然而，这些分子的确切空间排列目前仍不清楚。结晶结构的晶格常数和长程有序性取决于LPS的长度，这表明多粘菌素对LPS的局部取向一定位于周期结果的中心。值得注意的是，周期性的LPS-多粘菌素复合物意味着协同作用的存在。这反过来解释了为什么多粘菌素非常低的有效浓度。

除了这些与多粘菌素作用机制的微观联系外，结晶结构还会导致膜刚度与膜面积的增加。这与多粘菌素诱导细菌膜表面隆起的细菌表面形态学变化完全吻合。这些变形在原子力显微镜图像中表现为脂质的聚集和突起的形成。多粘菌素处理后脂质体和细菌膜的粗糙度增大。隆起外膜面积增加的结果，多余的脂质被推入隆起。随后，力学性质变化导致膜受到压力，最终导致其被破坏。综上所述，使用原子力显微镜对多粘菌素的作用机制提供了一个纳米级分辨率的力学模型。了解到多粘菌素通过与LPS形成特定结构，而不是与膜进行非特异性的相互作用。这于设计多粘菌素的变体以解决当前的抗菌素耐药性危机将是至关重要的。

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原文链接：

Manioglu, S., Modaresi, S.M., Ritzmann, N. et al. Antibiotic polymyxin arranges lipopolysaccharide into crystalline structures to solidify the bacterial membrane. Nat Commun 13, 6195 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33838-0

Bruker AFM介绍：

https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/microscopes/materials-afm/afm-for-polymer-research.html

https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/microscopes/materials-afm/afm-modes/peakforce-qnm.html

https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/microscopes/materials-afm/multimode-8-hr-afm.html