「Nature子刊」基于蛋白质组学揭示了胃癌潜在的治疗策略

2022年9月，复旦大学生命科学学院丁琛团队、复旦大学附属中山医院侯英勇团队、复旦大学附属中山医院沈坤堂、复旦大学附属中山医院刘天舒团队和上海交通大学附属新华医院赵健元团队在《Nature Communications》期刊(IF=17.694)发表的题为“ Proteomic characterization of gastric cancer response to chemotherapy and targeted therapy reveals potential therapeutic strategies”的研究成果，本研究通过分析了206个来自接受化疗或抗her2治疗的胃癌患者的肿瘤组织的蛋白质组。

本研究基于蛋白质组学的胃癌一线治疗预测分类器的构建和验证，在一定程度上有助于个性化化疗和靶向治疗，从而走向蛋白质组学驱动的精准医疗时代。

更重要的是，本研究提出了一种全面的蛋白质组学方法来预测对化疗和靶向治疗的反应，提出CTSE联合TKTL1可以促进更有效的临床决策，以确定基于doc的治疗对患者的相对益处，暗示了其预后和治疗意义以及可能有益于临床实践的潜在调节机制，并为研究胃癌化疗和靶向治疗的机制和指标提供了丰富的资源。

研究背景

胃癌（GC）是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，也是全球癌症相关死亡的第二大原因。胃癌的危险因素包括吸烟、高盐饮食、高肉类摄入量、胆汁反流和幽门螺杆菌感染等。目前，手术、化疗和放疗是胃癌的主要治疗策略。

术前化疗被认为是一种标准的治疗方法，也是提高局部晚期GC患者生存率的一种很有前途的方法。

三联化疗DOS（多西紫杉醇、奥沙利铂和S-1）和双重化疗XELOX（卡培他滨和奥沙利铂）已被确定为治疗局部和转移性胃癌的一线治疗方法。

最近的几项第二阶段的研究和最近的证据表明曲妥珠单抗与一系列治疗模式的联合使用已经支持了曲妥珠单抗+ XELOX治疗her2阳性晚期GC8-11患者的有效性和安全性。

然而，与曲妥珠单抗+ XELOX相比，曲妥珠单抗+ DOS联合治疗效果较差，中位OS更短，这尚未在临床中广泛应用，曲妥珠单抗联合化疗的耐药机制尚不清楚。

研究思路

研究方法

1. 非标记定量蛋白质组

2. MSI/MSS特性的评价

3. 单样本基因集富集分析（ssGSEA）

4. 目标PRM分析

5. 质粒构建

6. 慢病毒的产生和细胞转导

7. 蛋白质印迹法

8. 增殖试验

9. 免疫细胞化学和免疫荧光法

研究结果

1.胃癌患者对化疗和靶向治疗的反应

为了研究与化疗和靶向治疗反应相关的蛋白质组学模式，作者收集了206例化疗初期的胃癌患者的肿瘤组织，利用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE），随后通过基于质谱（MS）的标签进行分析自由量化策略（图1a），详细的临床特征见图1b。

生存分析显示，敏感组（S，N = 79)的生存率高于非敏感组（NS，N = 97）（图1c）。蛋白质组学检测结果显示，每个样本中有6369-8119个基因产物（GPs）(图1d）。S（11258个GPs）和NS（11388个GPs）之间的蛋白质组学覆盖率没有显著差异（图1e）。

图1| 胃癌的蛋白质组学分析综述

2.GC队列的蛋白质组学分型及其与治疗反应的关系

作者对179个样本的蛋白质组谱进行共识聚类分析，发现4种GCs蛋白质组亚型，其中28、56、75和20例患者分别分为G-I、G-II、G-III和G-II亚型（图2a），非敏感患者（SD和PD）的百分比从G-I的40%增加到G-IV的80%(图2b），在4个亚型中，G-IV的预后最差（log rank检验，P<0.05）（图2c）。

此外，作者确定了蛋白质组亚型与治疗亚队列或TNM分期之间存在明显的关联，但这种关联与分级、劳伦类型、原发部位或肿瘤纯度均未观察到（图2b）。在G-II亚型中，我们观察到糖酵解/糖异生和泛酸/辅酶a生物合成显著富集（Fig. 2d）。

为了研究蛋白表达与治疗耐药性的相关性，作者使用来自癌症依赖图谱项目（DepMap）的胃癌细胞系数据，分析了G-IV亚型中药物敏感性显著上调的细胞外基质蛋白与药物依赖性的相关性。作者鉴定了5个蛋白，包括THSD4、SRPX2、TGFBI、THBS1和LAMB2，它们与药物反应（5-FU、奥沙利铂或多西紫杉醇）高度相关（图2e）。

作者观察到过表达thsd4的MKN45细胞中多西紫杉醇、奥沙利铂和5-FU的半抑制浓度值显著高于空载体细胞（图2f）。

图2| 胃癌队列的蛋白质组学分型

及其与临床特征的关系

3.胃癌的MSS/MSI状态与肿瘤免疫微环境和治疗耐药性相关

为了进一步检验复旦GC队列（FDGC）的蛋白质组学分型算法在其他GC队列中是否可行，作者将相同的FDGC分型算法应用于三个独立的胃癌患者队列，观察到FDGC亚型和EOGC亚型或ACRG亚型，但不是FDGC亚型和BPRC亚型（图3a，b），这可能是由于FDGC亚型和EOGC亚型或ACRG亚型之间的成分相似，而BPRC队列只包括弥漫型癌症。

在ACRG队列和FDGC队列中，低MSI/MSS-sig与较差的临床结果显著相关（图3d），这与之前的研究一致。

此外，MSI/MSS-sig高的胃癌具有氧化磷酸化特征，而MSI/MSS-sig低的胃癌具有细胞外基质蛋白的高表达（图3e）。G-IV亚型中一组细胞因子、参与抗原加工的蛋白和MHCII类分子的持续下调（Fig. 3f）。与巨噬细胞M1相比，前体单核细胞聚集在G-IV亚型中（图3g，h）。

图3| FDGC分型算法在多个独立队列中的应用

以及MSI/MSS特征与临床结果的相关性

4.T细胞受体信号通路在DOS和XELOX化疗中发挥不同的作用

生存分析也表明，MSI-sig高水平的胃癌患者与DOS治疗中的总生存期呈正相关，而没有观察到MSI/MSS-sig水平与XELOX治疗的临床结果之间的差异（图4a）。根据图4b所示的KEGG通路注释，对每组过多的蛋白进行通路富集。

相反，在XELOX亚队列中，TCR信号通路为在XNSG中富集，高表达代表预后不良（图4c)。同时，TCR通路、GSEA分析显示，TCR信号通路是在XELOX非敏感患者中富集的基因信号通路，在DSG中有效，该通路的高激活在接受XELOX治疗的BPRC队列中表现更好（图4d）。

CD8 + Tcm、CD8+t细胞和cDC在XNSG中富集（图4e）。在BPRC队列中，XELOX等免疫效应细胞也在XELOX非敏感患者中富集（图4f）。

值得注意的是，在31种抗癌药物中，多西紫杉醇的ICD成分排名前一名，表明多西紫杉醇诱导免疫原性细胞死亡的能力更高（图4g）。在DSG和XNSG中发现的1099个蛋白的比例较高，这些蛋白参与了免疫调节和ERBB通路（图4h）。

图4| 敏感组和非敏感组治疗亚队列中

蛋白和信号通路的差异表达

如图4i所示，单变量cox分析确定了参与免疫调节的12种蛋白和ERBB信号通路在DOS亚队列中与无病生存（DFS）呈正相关，而在XELOX亚队列中呈负相关。NCI-N87细胞中XELOX和TRA的半抑制浓度值分别为36.6 μM和43.7μM（图4j）。GSEA分析还显示，TCR信号在XHSG中富集（P = 0.033），并与临床结果呈正相关（图4k）。xCell分析显示，XHSG中CD4+t细胞、CD4 + Tcm、CD8 + Tcm等免疫细胞的丰度显著增加（图4l）。XNSG中CD4阳性细胞和CD8阳性细胞的比例高于XSG中（图4m）。

综上所述，曲妥珠单抗与XELOX联合治疗可产生协同抗肿瘤作用，TCR信号通路和CD8 + Tcm成为联合治疗的良好反应标志物（图4n）。

5.ECM/PI3K-AKT通路的激活与抗her2靶向治疗的耐药性相关

作者重点关注HER2亚队列，并将该亚队列分为HER2敏感组（HSG）和非敏感组（HNSG）。HSG与HNSG之间的OS和PFS的预后有显著性差异（图5a）。Cox分析提示，ERBB2不能被认为是HER2亚队列中独立的预后因素。这些结果反映了HER2表达水平与曲妥珠单抗耐药性的低相关性（图5b）。

KEGG通路富集分析显示，HNSG具有ecm-受体相互作用、PI3K-AKT通路等特征。（图5c、d）。此外，ECM与临床结果呈负相关（图5e），ECM蛋白如COL4A1、COL6A5、FN1、GP1BA、ITGA4、THBS3和THBS4在曲妥珠单抗耐药细胞系47中也有过多的比例（图5f）。PI3K-AKT信号通路与ecm-受体相互作用通路的正相关性最高（图5g）。

HNSG中凋亡相关蛋白，包括BCL2、BCL2L1、CASP3、CASP7和CDKN2A的下调（图5h）。NCI-N87细胞中BUP和TRA的半抑制浓度值分别为8.19 μM和46.57μM（图5i）。

综上所述，ECM可激活PI3K-AKT通路，抑制细胞凋亡，从而削弱曲妥珠单抗的抗肿瘤作用（图5j）。

图5| HSG/ HNSG中蛋白和

信号通路的差异表达

6.胃癌化疗及靶向治疗预测模型的构建与验证

作者比较确定s-过度代表和ns-过度代表的蛋白质组是否可以区分敏感GC患者和非敏感GC患者对DOS治疗、XELOX治疗、抗her2治疗或联合化疗的反应（图6a）。通过对训练集进行了10倍交叉验证，获得了3个预测模型，其具有高灵敏度和特异性的预测模型（图6b）。此外，热图显示，在新的独立队列中，DSG与DNSG、XSG和XNSG、HSG和HNSG之间分别有明显的分离（图6c）。

图6| 预测性分类器的构建与验证

7.过表达CTSE通过稳定微管协同提高了对多西紫杉醇的敏感性

与细胞转染一个空载体，CTSE过表达显著促进MKN45和MGC803细胞的增殖（图7a，b）,CTSE过表达组的半抑制浓度值（图. 7c），而XELOX无明显变化（图7d），CTSE过表达组的DOC半抑制浓度值低于对照组（图7e）。

对未经处理的CTSE过表达和对照MKN45细胞的差异蛋白质组学分析显示，971个上调的GPs在基础转录因子中富集。进一步的差异蛋白质组学分析表明，CTSE过表达使MKN45细胞容易发生坏死，这表明CTSE对DOC有积极的反应（图7g）。

通过免疫印迹分析，验证CTSE组的DOC暴露降低了可溶性α-和β-微管蛋白亚基的含量，表明微管蛋白向微管的聚合增强，从而提高了DOC的敏感性（图7h）。

8.过表达TKTL1，通过诱导异常的染色体分离，降低了对多西紫杉醇的敏感性

TKTL1的过表达促进了MKN45和MGC803细胞系的细胞增殖（图7i，j）。通过比较TKTL1过表达细胞和对照细胞对DOS和XELOX的敏感性，发现TKTL1过表达细胞，而XELOX没有显著变化（图7k，l）。过表达TKTL1组DOC的半抑制浓度值高于对照组（图7m）。

在doc处理的tktl1过表达细胞中观察到严重的异常染色体分离表型，包括染色体错位、多极和滞后染色体（图7n）。与doc处理的对照组细胞相比，在doc处理的tktl1过表达细胞中观察到非整倍体性增加（图7o）。

在该模型中，CTSE通过微管稳定作用作为DOC化学敏感性的细胞内在增强剂，而TKTL1通过诱导异常染色体分离作为衰减剂（图7p）。

图7| 过表达CTSE和TKTL1过表达对胃癌细胞系MKN45和

MGC803中DOS和XELOX抗癌活性的影响

研究解读

1. 构建了一个涵盖三个临床治疗亚队列的胃癌队列，包括DOS亚队列（44例接受DOS治疗）、XELOX亚队列（70例接受XELOX治疗）和HER2亚队列（71例接受抗HER2治疗的患者）。

2. 蛋白质组学聚类的结果是四种具有不同功能的GC分子亚型，显示出与药物反应和临床结果相关。

3. 在其他独立的胃癌队列中验证了胃癌分型及其预后差异。

4. MSI-sig高状态的胃癌患者对DOS治疗反应敏感，而对XELOX治疗反应不敏感。

5. 曲妥珠单抗与XELOX或PI3K-AKT抑制剂的体外协同作用。

6. 开发了具有高精度的预后模型来预测化疗反应，在60例GC患者(XELOX（N=20）、XELOX（N = 20）、XELOX（N = 20）或抗her2（N=20）治疗。

7. CTSE作为多西紫杉醇化学敏感性的细胞内在增强剂，而TKTL1作为多西紫杉醇的衰减剂。

上海鹿明生物科技有限公司致力于质谱为核心的蛋白质组学方法开发，在超微量蛋白质组学方面有了新的突破。目前微量蛋白质组学驱动的精准医疗通过对临床样本的质谱检测实现发现疾病标志物，以及药物靶标的发现和验证正成为研究的热点。

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小七撰文

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