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Cell Metabolism | AD的罪魁祸首——Warburg样代谢转变！

麦特绘谱

2023.5.31

阿尔茨海默病（AD）是一种老年人口中最常见的痴呆症，也是世界范围内死亡的主要原因之一。近年来，转录组学、蛋白质组学和代谢组学发展成为更好地理解人类疾病相关改变的有力工具，诸如乳酸脱氢酶A（LDHA）和丙酮酸激酶M（PKM），已被认为是AD患者脑脊液中高度可重复性的生物标志物。由于缺乏足够的模型系统来再现AD患者人类细胞的散发的、年龄依赖的变化，AD患者神经元的代谢机制和细胞变化尚不清楚。来自奥地利因斯布鲁克大学的Jerome Mertens团队揭示了PKM2在AD患者神经元病变中诱导代谢重编程及对转录网络的表观调控新机制，为AD治疗提供了潜在的重要药物靶点。相关研究成果发表于Cell Metabolism。

从AD患者的成纤维细胞中转化为功能性iNs

从11名AD患者和11名非AD患者中提取穿刺活检和皮肤成纤维细胞进行培养，对照组和AD患者根据年龄、脂蛋白E（ApoE）基因型和性别进行匹配，以减少潜在的遗传偏差。使用基于转录因子的直接神经元转换策略，过表达两个转录因子Ascl1和Ngn2，从供体成纤维细胞中生成诱导神经元（iNs），iNs具有与供体患者相同的衰老特征。21天后，大多数成纤维细胞转化为成熟的神经元形态，通过荧光激活细胞分选（FACS）分离出神经元表面标志物PSA-NCAM阳性细胞，并提取培养出转化成功的iNs（图1）。

图1. 从AD患者的成纤维细胞中转化为功能性iNs

基因共表达分析揭示代谢调控异常

对AD患者（n=21）和对照组的iNs进行转录组检测，以探究患者的iNs中与AD相关的基因表达模式的变化。加权基因相关网络分析（WGCNA）分析表明，共产生29个不同的基因模块，代表了所有样本中具有类似表达变化的基因。对那些显著的、可解释的生物功能富集的模块进行基因集富集分析（GSEA）后，获得14个显著富集的模块。模态关系分析最终确定了6个模块，它们与诊断（AD或控制）和受试者的认知能力（MMSE）高度相关；将这些模块称为AD患者iN模块（ADM1-ADM6）。其中，ADM1-3与AD诊断呈正相关，而ADM4-6则呈负相关，且均不受年龄、性别或载脂蛋白基因型的影响。

随后，利用来自尸检（PM）的AD患者和对照组的30个海马组织样本的转录组数据计算参考模块，研究AD相关基因模块在iNs中的表达在多大程度上反映了人类体内状态。模块-特征-关系分析产生了20个不同的共表达模块，其中7个被确定为AD PM模块（PMM1-PMM7），PMM1-3与AD诊断呈正相关，PMM4-7与AD诊断呈负相关。且ADM1-6和PMM1-7的GSEA表明iN和PM AD模块之间有大量的功能重叠。在ADM1-3中显著富集的通路中，有11个（29.0%）也在PMM1-3中富集，而在ADM4-7中的富集的通路中，有48个（42.1%）也在PMM4-7中富集。通路分析还揭示了AD的代谢异常。前10个最重要的UniProt关键词涉及磷酸化、替代剪接和乙酰化，而前10个最重要的KEGG通路涉及碳代谢。进一步鉴定导致iNs产生AD特征及基因模块差异的具体代谢调控因子，发现肌肉型丙酮酸激酶（PKM）的编码基因所涉及的差异化基因模块最多。因此，推测涉及PKM的代谢异常和表观遗传调节可能导致AD神经元病变（图2）。

图2. AD患者iNs和尸检脑组织的基因共表达网络分析

AD患者iNs呈现PKM异构体的转换和类似Warburg的代谢特征

PKM是研究最多的丙酮酸激酶同工酶，催化糖酵解的最后一步反应，PKM是Warburg效应的关键介质之一，是调控肿瘤代谢的关键酶，也是肿瘤发生中导致恶性表观遗传转化的核因子。PKM编码基因可以通过对mRNA的选择性剪接第9或第10外显子而分别表达PKM1和PKM2两种同工酶。其中，PKM1主要在肌肉和脑这些对能量需求旺盛的分化终末细胞中表达，代谢活性强，有利于丙酮酸合成及线粒体的氧化磷酸化，而PKM2则主要在肿瘤细胞等对合成代谢需求强的组织细胞中表达，与Warburg效应有关，代谢调节活性较弱。

尽管PKM是AD患者iNs的基因模块分析中的关键基因，但PKM的总mRNA水平在对照组和AD患者iNs之间无显著差异。转录组数据中的PKM异构体定量显示，AD患者iNs中的PKM2显著增加。这种变化在供体成纤维细胞中并不存在，这表明它不是从成纤维细胞转移过来的，而是一种神经元特异性现象。此外，在来自633个PM前额叶皮层样本的转录组中，在诊断为AD的患者死亡时，PKM1水平下降，PKM2水平增加，PKM2/PKM1比值也显著增加。另一队列（10个健康对照大脑和9个散发性AD患者的大脑）的AD PM前额叶皮层切片的免疫荧光分析显示，在神经元丰富的分层中，PKM2免疫荧光水平升高。在AD切片中， PKM2的强度在NeuN区域显著增加，同时与AD相关的PKM2主要定位在神经元核而非核外区域。并且AD患者iNs同样显示出PKM2蛋白水平的增加（图3）。

图3. AD患者iNs和尸检脑组织中的PKM异构体转换

为了评估AD中神经元PKM2 mRNA和蛋白升高的功能后果，检测丙酮酸水平以评估iNs中PKM的代谢酶活性。结果表明，与对照组iNs相比，AD患者iNs显示出PKM的活性显著下降，乳酸显著增加。利用代谢组学分析，共检测到160种代谢物，主成分分析（PCA）表明，沿着PC7可以显著区分对照组和AD患者iNs，该成分在功能上涉及糖酵解通路和酶。为了揭示与AD相关的PKM功能障碍最显著的代谢通路，使用在线多组学分析工具IMPaLA对转录组和代谢组数据进行整合，结果表明，碳代谢是AD患者iNs中最关键的代谢通路。随后评估了糖酵解代谢物和代谢酶基因，结果表明，糖酵解代谢转运体和酶的mRNA丰度显著增加。此外，糖酵解的中间代谢物葡萄糖-6-磷酸、1,3-BP-甘油酸、磷酸烯醇丙酮酸（PEP）和细胞内乳酸水平增加，证实了AD患者iNs中类似Warburg的代谢向糖酵解的转换。另外，还检测到AD患者iNs的葡萄糖摄取量显著增加。总之，这些变化提示糖酵解代谢物的显著增加。且与大多数癌症相似，糖酵解的转换发生在没有线粒体衰竭的情况下，因为¹³C葡萄糖示踪结果显示柠檬酸通量不变。线粒体的PDH（丙酮酸脱氢酶）的蛋白水平不变，TCA循环代谢物的总水平无差异，线粒体膜电位正常，AD神经元的ATP/ADP比值不变。此外，SDH活性不变（ETC的复合体II），提示线粒体氧化磷酸化保持不变。因此，乳酸的增加并不是以TCA循环为代价，而是能够维持线粒体氧化代谢并增加葡萄糖消耗，从而使得糖酵解高于正常水平。因此，AD患者iNs中PKM2的表达量增加会使其发生与肿瘤细胞类似的Warberg样代谢转换，糖酵解活性增加（图4）。

图4. 代谢组揭示AD iNs中类似Warburg的代谢转变

PKM2的转换增加和核转位损害AD患者iNs的表观遗传

PKM1形成的四聚体复合物不能进入细胞核，而PKM2形成的二聚体复合物可以进入细胞核，且在核转位后获得蛋白激酶活性，因此PKM2表达量增加会促进PKM的核转位。其中，PKM2在丝氨酸的磷酸化（pPKM2）是触发其核转位的关键步骤。对p-PKM2的免疫细胞化学分析显示，AD患者iNs中p-PKM2的核信号显著增加。核p-PKM2会磷酸化组蛋白3上的苏氨酸11（H3T11-P），免疫细胞化学显示，AD患者iNs中H3T11-P核信号显著增加，表明PKM2在AD患者iNs核内的蛋白激酶活性增加。

由于与HIF1α、STAT3和b-catenin的结合是致病性核PKM2促进癌症转化的关键机制，利用染色质转座酶可及性（ATAC）测序数据，从对照组和AD患者iNs（n = 20）检查这些转录因子调节的基因周围的染色质可及性，iATAC-seq和ChIP-seq的整合数据表明，HIF1α和STAT3调控基因周围的染色质可及性增加，而b-catenin调控的基因中染色质可及性无差异。AD患者iNs中不同可及染色质区域的HIF1α和STAT3结合显著富集，验证了HIF1α和STAT3转录激活的PKM2促进作用。且73%受HIF1α调控的基因和64%受STAT3调控的基因在AD患者iNs中的mRNA丰度出现上调。GSEA显示，由PKM2::HIF1α诱导的基因参与了前体代谢物的生成以及能量和碳水化合物的代谢过程，PKM2::STAT3诱导的基因则促进了损伤信号传导、细胞因子活性和细胞凋亡。因此，AD患者iNs中PKM2的表达增加通过核转位的增强而调控了iNs的表观及转录程序，如细胞凋亡和能量代谢（图5）。

图5. 核PKM2活性改变了神经元的表观遗传景观

iNs中的有氧糖酵解增强导致低成熟的凋亡能力

神经元向低成熟状态的去分化会加速AD的病理生理学。尽管散发性AD患者iNs显示出低成熟状态，并且凋亡模块在基因模块ADM2中显著富集，但在标准培养条件下，未观察到对照组或AD患者iNs对凋亡标志物caspase-3（Casp3）的阳性反应。随后用凋亡诱导物ABT-737处理AD患者iNs，结果显示，凋亡标志物Casp3阳性的细胞比例呈剂量依赖性增加。且与对照组细胞相比，AD患者iNs对0.16 mM和更高浓度的细胞死亡反应增加。当把对照和AD患者iNs暴露于0.3mM的ABT-737时，对照和AD患者iNs的Casp3染色分别增加3和5倍。且Casp3阳性细胞的倍数增加与代谢组检测到的糖酵解中间产物的倍数增加显著相关，表明神经元的代谢转换与它们的低成熟凋亡能力有直接关系。

为了确定AD神经元的代谢转变是否直接导致其凋亡能力，将细胞暴露于100mM氯化钴（CoCl2）和100mM去铁胺（合称CoDo），诱导对照组神经元的有氧糖酵解，结果显示，乳酸增加，PKM2转位到细胞核显著增加，提示CoDo在对照组iNs中引起缺氧表型，有氧糖酵解增加。为了监测PKM2对CoDo的细胞核转位变化，将EGFP标记的PKM2融合蛋白（EGFP:PKM2）克隆到慢病毒载体中，并设置对照组iNs。EGFP::PKM2表达2天后的荧光成像显示，CoDo在处理后一小时内诱导PKM2核易位；将CoDo处理的对照组iNs暴露于0.3mM ABT-737时，Casp3阳性的iNs显著增加。且PKM2过表达的iNs（PKM2-OE）的代谢组学显示了与AD患者iNs非常相似的糖酵解代谢物积累模式。因此，偏向有氧糖酵解的代谢重编程，导致神经元对凋亡刺激的反应能力增强，进而加剧AD发生时神经元的细胞凋亡（图6）。

图6. 神经元中的代谢转变诱导类似AD的凋亡能力

PKM2的化学抑制可阻止核转位并改善神经元AD表型

鉴于PKM2在癌症中的关键作用，已开发出诱导PKM2形成四聚体而无法进入细胞核的PKM2抑制剂（如Shikonin），可以有效降低有氧糖酵解和PKM2的核转移，进而抑制癌症发生。结果显示，10mM的PKM2抑制剂shikonin在数小时内可有效阻止EGFP:PKM2的核易位。长达10天的处理未导致神经元形态学改变；免疫细胞化学分析显示，长时间的shikonin处理使p-PKM2的核质比降低15%。shikonin处理导致AD患者iNs的H3T11-P信号在第10天显著降低，并导致PKM2的神经元蛋白水平降低50%。

由于PKM2-OE足以诱导Warburg样代谢转换，随后探究Shikonin处理是否会改善Warburg样特征并恢复成熟的神经元代谢状态。代谢组学结果显示，Shikonin处理AD患者iNs可恢复到对照组iNs的代谢状态，且未检测到上游PEP或1,3-BP-甘油酸的积累，表明重新获得了PKM1酶活性，且降低了糖酵解代谢物的积累，并使神经元乳酸分泌恢复到正常水平。转录组结果表明，Shikonin处理显著且持续地导致AD患者iN样本向对照样本的整体转录组转移；shikonin减轻了AD患者iNs的癌变样转录组特征，因为它抑制了致癌转化和细胞凋亡相关的基因组，并抑制iNs转化为未成熟的转录组特征，恢复了与成熟突触特性相关的正常基因表达模式。并且在shikonin处理后，凋亡神经元数量显著减少。因此，抑制PKM2活性能够恢复AD患者iNs的转录和代谢稳态，抑制神经元凋亡，促进其恢复成熟神经元的正常功能（图7）。

图7. PKM2的化学抑制可改善凋亡能力

小结

本研究利用诱导神经元（iNs）模型，发现AD患者iNs中PKM2剪接体表达上升会诱导iNs有氧糖酵解活性增强，发生类似Warburg效应的代谢重编程；并促进PKM2的核转位诱导关键转录因子的表达而导致神经元命运丧失和细胞凋亡的发生。而抑制PKM2活性能够恢复AD神经元的代谢，阻滞PKM2的核转位，抑制凋亡调控基因的表达，缓解AD神经元病变；提示PKM2可作为AD治疗的潜在靶点。

参考文献

Warburg-like metabolic transformation underlies neuronal degeneration in sporadic Alzheimer’s disease. Cell Metabolism. 2022.

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本研究利用代谢组发现AD患者iNs中呈现类似Warburg的偏向糖酵解的代谢转换，并与转录组、表观调控研究等整合分析，揭示碳代谢是AD患者iNs中最关键的代谢通路。本公司经典的已获得客户高度肯定的Q300全定量检测技术和升级的新品Q1000技术，均可精确捕捉到论文中提到的代谢途径中所有小分子产物的细微改变。目前Q300技术已助力客户在Science, Cell Metabolism, Gut, Advanced Science, Diabetes Care, Nature Communications, PNAS等权威期刊发表近60篇SCI文章，平均IF>10分。

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