赛默飞色谱与质谱分析

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请看来自用户实测Orbitrap Astral高分辨质谱仪数据！

赛默飞色谱与质谱中国

2023.7.10

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齐英姿

全新的Thermo Scientific™ Orbitrap™ Astral™ 高分辨质谱仪一经发布，就引起了业界的广泛关注。使用Orbitrap Astral 高分辨质谱仪的研究数据也已经有了不同方向的相关报道【1-4】，涉及从原理到应用的各个方向。我们今天来到蛋白质组学一直非常关注的两个领域，即血液样品检测及单细胞蛋白质组学数据【3-4】，来看来自我们用户的Orbitrap Astral 高分辨质谱仪的详实数据，来关注更灵敏的、更加精准的来鉴定与定量蛋白。

第一篇

第一篇文章来自于华盛顿大学Michael J. MacCoss教授课题组，讲述了对于像是体液样品这样的具有更大的蛋白表达动态范围的样品，Orbitrap Astral高分辨质谱仪在定性和定量上的优异表现。相比于复杂的细胞样品，体液样品的蛋白表达特点是具有更大的动态范围，甚至会达到10个数量级的水平。我们期待使用高分辨质谱技术对于体液样品更低丰度蛋白进行解析，还期望能在整个蛋白质组的水平对其进行精准定量，这对于质谱仪的灵敏度与定量性能都提出了极大的挑战。

Orbitrap Astral高分辨质谱仪因其几乎无损的离子传输效率以及AGC技术的加入，使其具备了更好的灵敏度及动态范围表现，使得它在这种动态范围更大的体液样品鉴定中的表现更加值得期待。而定量的准确性更是差异蛋白质组学的重点，作者使用了DIA采集模式，使用基于谱图库检索和skyline软件进行数据处理，对Orbitrap Astral高分辨质谱仪的定量性能进行了着重的评估与分析。

作者首先对比了Orbitrap Astral高分辨质谱仪以及现行的Orbitrap系列质谱仪，当使用相同的梯度时，即使在使用较大的离子注入时间，降低了Orbitrap Astral 高分辨质谱仪的采集速度的前提下，Orbitrap Astral 高分辨质谱仪的每张谱图仍然能采集到更多的数据点；而Orbitrap Astral高分辨质谱仪提供的更好的离子并行化处理，使得即使给到相同的离子注入时间，Orbitrap Astral高分辨质谱仪也能拥有更快的速度。基于这些优势，Orbitrap Astral高分辨质谱仪检测到的肽段数量增加了70%（87,257 vs 51,603）。

图1：24min色谱梯度，HeLa样品离子统计

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而后作者使用Orbitrap Astral高分辨质谱仪 24min梯度数据与现有的常规Orbitrap 仪器90min梯度数据集进行比较：Orbitrap Astral高分辨质谱仪上使用不同的采集离子注入时间及窗口大小的方法，Orbitrap Astral高分辨质谱仪可以在更小的隔离窗口中仍然得到更复杂的谱图，采集到更多的数据信息。在鉴定能力上，24min梯度的不同方法的Orbitrap Astral高分辨质谱仪仪器均能够得到7700-8200个蛋白的鉴定，58,000 - 75,000条肽段鉴定；而90min的Orbitrap仪器则能够得到6885个蛋白的鉴定及55,981条肽段鉴定。这意味着与现行的蛋白质组学的金标准Orbitrap仪器相比，Orbitrap Astral高分辨质谱仪在低于3.5倍的时间内，得到了更多的鉴定信息。

图2：24min梯度 Orbitrap Astral高分辨质谱仪数据与90min梯度Orbitrap Fusion Lumos数据比较

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除鉴定数据外，可定量蛋白与多肽的统计是更加严格的统计方法。而在定量精密度上，Orbitrap Astral高分辨质谱仪在能够得到更佳的鉴定结果的同时，其采集的数据的精密度与Orbitrap采集的数据还能保持一致。结果说明，Orbitrap Astral高分辨质谱仪可以在更短的梯度时间内产生鉴定量更高的高质量的数据。

图3：Orbitrap Astral高分辨质谱仪定量精密度

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在对Orbitrap Astral高分辨质谱仪的定量能力进行定量准确性测试中，所使用的材料为不同混样比例的SILAC轻重标HeLa肽段。24min梯度的Orbitrap Astral高分辨质谱仪可定量的肽段数为46,038，而90min梯度的常规Orbitrap仪器可定量的肽段数为40,098；经计算方法改进后的结果中，24min梯度的Orbitrap Astral高分辨质谱仪可定量的肽段数为58,330，90min梯度的常规Orbitrap仪器可定量的肽段数为47,671。除了可定量肽段数目多与常规的Orbitrap仪器，在两种仪器都可以定量的肽段中，Orbitrap Astral 高分辨质谱仪定量肽段的LLOD也略好于常规Orbitrap。

图4：Orbitrap Astral高分辨质谱仪定量准确性

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Orbitrap Astral高分辨质谱仪的AGC功能，可以控制离子的注入时间，更有利于对于血浆这样的高动态范围样品的检测。值得关注的是，在血浆样品的检测中作者团队开发了一套全新的处理方案，使用基于磁珠的方法从血浆中富集覆膜颗粒组分。经处理后的样品，使用Orbitrap Astral高分辨质谱仪，分别使用了30min短梯度及60min长梯度，并使用不同的隔离窗口、离子注入时间及扫描速度方法，分别进行检测。

血浆样品的最佳鉴定条件为60min色谱梯度下，4Th的隔离窗口，15ms的最大离子注入时间，得到了5163个蛋白及44668条肽段。而在30min的色谱梯度下，4Th的隔离窗口，10ms的最大离子注入时间，也可以得到4704个蛋白及37534条肽段。值得注意的是，所采用的所有的采集方法，都可以在高质量数据的前提下得到4200个以上的蛋白，这说明Orbitrap Astral高分辨质谱仪非常适合来检测血浆这类高动态范围的样品。而且，Orbitrap Astral 高分辨质谱仪可以在动态范围非常宽的样品中检测到更多的我们想要看到的生物标志物的信息。

图5：Orbitrap Astral高分辨质谱仪血浆样品定量结果

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第二篇

另一篇来自Erwin M. Schoof团队的文章则探讨了Orbitrap Astral高分辨质谱仪在单细胞蛋白质组学水平的检测能力。现在单细胞蛋白质组学的目标在于改进单细胞的鉴定深度以及单位时间内检测的细胞的通量，传统的Orbitrap仪器为我们提供了高分辨率，但这需要比较大的离子注入时间，产生高质量的可定性和定量的谱图可能需要几百毫秒。Orbitrap Astral高分辨质谱仪因其更高的扫描速度且在离子传输过程中几乎无损，使得它有更值得期待的灵敏度表现。

具体来说，作者使用了细胞周期细胞HEK293以及原发性急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia,(AML) 培养模型，来验证Orbitrap Astral高分辨质谱仪仪器在单细胞蛋白质组学检测上的表现。首先通过HeLa肽段，来进行质谱参数的探索。使用uPAC Neo “Low Load”色谱柱，18min总梯度，以每天80个样品的通量进行检测，在使用1ng上样量进行检测时，其最佳离子注入时间为20ms，使用250pg上样时，其最佳离子注入时间则为40ms，较长的离子注入时间和略宽的隔离窗口帮助我们对超低上样量样品实现更深的蛋白覆盖能力。从鉴定结果来看，Orbitrap Astral高分辨质谱仪在保持高质量数据的前提下（大多数蛋白的cv值均小于20%），与Orbitrap Eclipse相比，其蛋白鉴定数增加了一倍。

图6：Orbitrap Astral高分辨质谱仪低上样量参数优化

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由Orbitrap Astral高分辨质谱仪产生的数据，还可以准确的揭示蛋白变化控制细胞周期进程的趋势，这一数据证明了基于Orbitrap Astral高分辨质谱仪的scp-MS工作流产生准确生物学数据的能力。

图7：细胞周期蛋白的变化

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为了检测Orbitrap Astral高分辨质谱仪检测来源相似的高度相似细胞的细胞异质性的能力，对从4个群体中分别获得的54个AML模型细胞进行检测，在细胞群中鉴定到了3892个蛋白，每个细胞平均鉴定出超过2000个蛋白。对Orbitrap Astral高分辨质谱仪鉴定到的蛋白进行分析，很大一部分都是中低端丰度的蛋白，其中所鉴定到的转录因子增加了接近8倍，激酶数量增加了2倍，这些数据说明Orbitrap Astral高分辨质谱仪在单细胞水平检测能力的增加对于提升我们的生物学认知起到了关键的作用。在细胞的异质性检测中，数据可以清晰地展现白血病模型中的表型多样性，蛋白在细胞不同的分化阶段表现出异质性的表达模式，这说明单细胞蛋白质组学的数据捕获到了非单细胞数据可能会遗漏的蛋白在不同细胞阶段的渐进变化。

图8：AML模型细胞的单细胞蛋白质组学分析

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相信大家对Orbitrap Astral高分辨质谱仪在蛋白质组学领域的鉴定和定量能力有了更为全面详细的了解，如果大家希望更详细的了解关于Orbitrap Astral高分辨质谱仪的数据，也欢迎阅读相关文献~

参考文献：

[1] Stewart H, Grinfeld D, Giannakopulos A, et al. Parallelized Acquisition of Orbitrap and Astral Analyzers Enables High-Throughput Quantitative Analysis[J]. bioRxiv, 2023: 2023.06. 02.543408.

[2]Guzman U H, Martinez del Val A, Ye Z, et al. Narrow-window DIA: Ultra-fast quantitative analysis of comprehensive proteomes with high sequencing depth[J]. bioRxiv, 2023: 2023.06. 02.543374.

[3] Heil L R, Damoc N E, Arrey T N, et al. Evaluating the performance of the Astral mass analyzer for quantitative proteomics using data independent acquisition[J]. bioRxiv, 2023: 2023.06. 03.543570.

[4] Petrosius V, Aragon-Fernandez P, Arrey T N, et al. Evaluating the capabilities of the Astral mass analyzer for single-cell proteomics[J]. bioRxiv, 2023: 2023.06. 06.543943.

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周锦帆