技术简介

染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究体内蛋白质与 DNA 相互作用的有力工具，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。将 ChIP 与新一代测序技术相结合的 ChIP-Seq 技术，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的 DNA 区段。

技术原理

技术应用

用于在全基因组范围中研究 DNA 结合蛋白（相互反应）、组蛋白修饰（表观遗传标记）和核小体的技术，可有助于了解基因之间的相互调控以及染色体的功能结构。常用于 1. 查找或验证 TF(转录因子）与靶基因间的相互关系；2. 验证 lncRNA 募集的转录因子与靶基因之间相互关系；3：组蛋白修饰的整体情况。

伯豪优势

1. 建库质量高，失败率极低，每年五万例左右各种类型样本文库构建经验。

2. 质控过程全程可溯，实时跟踪，反馈及时，确保数据真实可靠。

3. 基础分析丰富，展示形式可个性化定制。

4. 高级分析服务：专业的生物信息分析团队，熟悉各种分析算法和软件；根据客户的需求，提供多种个性化的实现方案。

样本要求

样品需求（ChIP 富集的 DNA）

样品纯度：OD 260/280 值应在 1.8～2.0 之间。

样品浓度：最低浓度不低于 20ng/ul。

样品总量：每个样品总量不少于 30ng。

DNA 片段大小：长度分布小于 500bp，峰在 300bp 左右。

样品溶剂：溶解在 H20 或 low TE（pH8.0）中。

样品运输：低温运输（-20℃）；建议用 LoBind 管，parafilm 将管口密封好，以免污染。

数据分析

案例展示

案例一：北大肿瘤医院发现 C8orf76 基因通过直接上调 lncRNA DUSP51P 促进胃癌发生和转移

研究背景

胃癌排全球癌症死亡率第三位，大约一半的胃癌患者的 DNA 会表现出染色体不稳定性，包括基因拷贝数的增加和减少。

早前已证明染色体的拷贝数扩增经常发生在染色体区域 8q22,8q24 和 20q11-q13，并且与胃癌患者短暂的生存期显著相关。与邻近的非肿瘤粘膜组织相比，C8orf76（即 8 染色体的第 76 个开放阅读框）是一种核蛋白编码基因，在原发性胃癌中优先扩增。

C8orf76 基因位于染色体 8q24.13 上。已有相关文献报道 C8orf76 过表达与肾癌，子宫内膜癌和乳腺癌的不良预后相关，因此在本研究中，作者评估了 C8orf76 在胃癌中的拷贝数扩增和过表达状态，并描述了 C8orf76 在胃癌发生中的功能机制和临床影响。

研究思路

研究结果

客户通过前期高通量筛选发现 C8orf76 在胃癌（GC）中拷贝数增加，并且在两个独立的 GC 病人队列中验证发现 C8orf76 的表达上调。接着通过一系列细胞、动物实验证明 C8orf76 在 GC 中扮演促进细胞增殖、迁移 / 入侵、肿瘤发生 / 转移的重要作用。通过对 shC8orf76 细胞和对照细胞进行 RNA-seq 分析发现在 MAPK 信号通路、细胞循环，p53，wnt，TGF, 凋亡和 ErbB 的异常调节，说明 C8orf76 通过激活 MAPK 信号通络而促进肿瘤的发生。通过预测发现 C8orf76 是核内的潜在转录因子，经 ChIP-seq（由伯豪生物提供）分析发现 C8orf76 会直接调控 lncRNA DUSP51P，最后发现 siRNA DUSP5PA 后，会明显抑制癌症进程。

因此全文通过完整的实验设计证实了 C8orf76 直接与致癌的 lncRNA DUSP5P1 结合以诱导其表达并激活 MAPK 信号传导，从而促进癌症发生，同时还发现 C8orf76 可作为 GC 患者的预后因子。

参考文献

Wang X, Liang Q, Zhang L, et al. C8orf76 promotes gastric tumorigenicity and metastasis by directly inducing lncRNA DUSP5P1 and associates with patient outcomes[J]. Clinical Cancer Research, 2019, 25(10): 3128-3140.

案例解析

Olig2靶向染色质重塑到增强子并起始少突细胞的分化

少突细胞是一种中枢神经系统髓鞘形成中特殊的细胞类型，在大脑发育和神经元功能中起着重要作用。少突细胞的发育要经历OL祖细胞，前OL祖细胞，未成熟和成熟OL阶段。该研究中，研究人员发现ATP依赖的SWI/SNF染色质重塑酶Smarca4/Brg1的活化对于少突细胞的分化是必要的，并足以起始和促进少突细胞世系进程和成熟。通过ChIP-seq对少突细胞进行全基因组范围研究，揭示了少突细胞世系决定因子Olig2指导Smarca4/Brg1结合到少突细胞特异的增强子上。功能性分析Smarca4/Brg1和Olig2并结合染色质的遗传标记，揭示了阶段特异的顺式调节元件。综上研究结果显示，Olig2活化功能特异的Smarca4/Brg1依赖的染色质重塑调节与转录相关的染色质修饰，这对于精确地起始和建立转录的程序至关重要。这个过程促进了少突细胞的分化以及随后的髓鞘形成。

在OPC分化的起始阶段，Brg 1基因主要被RNAPⅡ调控。

Olig2 阻碍Brg1结合到E-box增强子元件

原文出处：Yu Y, Chen Y, Kim B, et al. Olig2 targets chromatin remodelers to enhancers to initiate oligodendrocyte differentiation. Cell. 2013.

染色质免疫沉淀-测序（ChIP-Seq）

概述
染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）也称结合位点分析法，是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。利用该技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。

ChIP-Seq的原理是：首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。

应用领域

由于ChIP-Seq的数据是DNA测序的结果，为研究者提供了进一步深度挖掘生物信息的资源，研究者可以在以下几方面展开研究：

（1）判断DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰；

（2）检测RNA polymerase II及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位；

（3）研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系；

（4）CTCF转录因子研究。

技术路线
1．实验流程（Solexa）

实验流程示意图

生物信息分析流程示意图

研究内容
1．测序
对客户提供的ChIP样品（如果有阴阳参启动子区域或DNA序列的）进行定量检测，检测合格后进行测序文库构建、DNA成簇（Cluster generation）扩增、高通量测序。

2．基本数据分析
数据产出统计：对测序结果进行图像识别（Base calling），去除污染及接头序列；统计结果包括：测定的序列（Reads）长度、Reads数量、数据产量。

3. 高级数据分析
标准高级数据分析内容包括：
（1）ChIP-Seq序列与参考序列比对；
（2）Peak calling：统计样品Peak信息（峰检测及计数、平均峰长度、峰长中位数）；
（3）统计样品Uniquely mapped reads在基因上、基因间区的分布情况及覆盖深度；
（4）给出每个样品Peak关联基因列表及GO功能注释；
（5）在多个样品间，对与Peak关联基因做差异分析。

技术特点

分辨率高：精确至单个碱基。

检测范围广：覆盖全基因组，可以研究在基因组上稀有存在的目的位点（Sharp binding）。

信噪比高：没有动态量程局限，背景低。

需要的样品量低：每个样品仅需要10-50ng的DNA。

灵敏度高：每个ChIP样本可获取数百万个有效序列标签。

应用领域
由于ChIP-Seq的数据是DNA测序的结果，为研究者提供了进一步深度挖掘生物信息的资源，研究者可以在以下几方面展开研究：

（1）判断DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰；
（2）检测RNA polymerase II及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位；
（3）研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系；
（4）CTCF转录因子研究。

案例分析

染色质免疫沉淀-测序案例研究

Ellen Markljung等利用ChIP-Seq技术，发现：家猪IGF2基因（编码Insulin-like growth factor 2）第三内含子单碱基G→A的替换，导致抑制因子ZBED6在该基因上结合位点的丧失，从而使IGF2在骨骼肌中上调表达（表达量是正常情况的3倍），这一突变主要影响肌肉生长（提高了骨骼肌的数量，因此猪肉产量提高了3~4%）、心脏增大和脂肪沉积。

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注：该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案，不可用于临床诊断或治疗等相关用途