lncRNA高级分析

基于差异lncRNA，差异gene数据，计算每个lncRNA与gene的pearson相关系数，筛选相关系数0.8以上且p值小于等于0.05的关系对，对这部分gene进行GO，KEGG分析，预测对应lncRNA的功能及可能参与的通路。在共表达的基础上，基于结合自由能，利用FEELnc软件预测lncRNA-gene直接调控关系与共表达结果取交集过滤，结合位置信息进行lncRNA cis功能预测。进一步利用共表达数据，根据RIsearch-2.0软件预测候选共表达lncRNA和gene的直接调控关系，用clusterprofile软件进行lncRNA转录因子关联分析。

用途

分析预测lncRNA的功能，作为下一步挑选的参考依据

前置分析条件
客户数据同时包含lncRNA数据以及mRNA数据。样本数量不少于6个
限定物种：人，小鼠，大鼠

分析结果
差异lncRNA和差异gene的共表达关系对以及差异lncRNA和gene的circos图
lncRNA的功能预测（GO，KEGG）
lncRNA周边gene的cis调控作图
lncRNA 靶基因预测分析
lncRNA 转录因子关联分析

Demo示例
1.lncRNA与mRNA共表达分析

Demo结果解读
·  利用皮尔森相关性检验（pearson）根据差异lncRNA与差异gene表达量数据，
计算两者表达相关性，挑选相关系数不低于0.8,且p值小于等于0.05的关系对。
·  同时用Circos图对差异lncRNA和差异gene的分布作直观展示。
·  最 外圈为该物种的常染色体分布示意图；第 1圈和第2圈为差异表达gene在染色体上分布，

红色线条表示上调，绿色线条表示下调，柱子越高，表示该区间差异基因数目越多；
·  第4圈和第5圈为差异表达lncRNA在染色体上的分布，表现形式同gene；

内部连线表示Top500共表达lncRNA和gene的对应关系

2.lncRNA功能预测

Demo结果解读
对于每一个lncRNA共表达差异gene GO富集结果，分别筛选三种分类

（Molecular Function、Cellular Component、Biological Process）对应p值较小前10条条目，

绘制条形图，Y轴为条目名称，X轴为-log10Pvalue

Demo结果解读

对于每一个lncRNA共表达差异gene GO富集结果，分别筛选不同KEGG一级分类（Cellular Processes, Environmental Information Processing, Genetic Information Processing , Human Diseases, Metabolism, Organismal Systems）对应p值较小的前10条条目，绘制气泡图，气泡越大则包含的差异基因数目越多，颜色由灰-红变化，富集pvalue值逐渐变小，表示显著程度逐渐增大。

3.lncRNA与其临近编码基因的cis分析

Demo结果解读

使用FEELnc软件搜索差异表达lncRNA其上下游100k范围内的所有编码基因，并与该lncRNA有显著共表达（皮尔森相关性计算）的差异基因取交集，这些在基因组上临近且表达模式上存在共表达的基因很可能被该lncRNA所调控。

筛选p值较小的top20关系对，绘制lncRNA与mRNA的顺势调控示意图，*代表p值显著性的等级，***为显著p（0,0.001）、**为次优显著p（0.001，0.01），*为显著p（0.01，0.05）；Y轴左右分别为mRNA与lncRNA；X轴为mRNA与lncRNA的距离，负值表示上游，正值表示下游；相同lncRNA表示为同一颜色条形图。

4.lncRNA trans靶基因分析

Demo结果解读

基于差异共表达结果结合自由能，利用RNA互作软件RIsearch-2.0预测候选共表达lncRNA和gene在核酸水平上的结合情况，按照两条核酸分子直接互作的碱基数不少于10个，且碱基不大于-100为筛选条件，筛选出的互作lncRNA和gene可能存在直接调控，p值从小到大排序，取top500关系对，绘制lncRNA-gene靶标互作网络图。红色节点表示lncRNA，绿色节点表示gene，节点大小代表关系对数量多少。

5.lncRNA 转录因子关联分析

Demo结果解读

基于差异共表达结果，对于每一个差异表达的lncRNA，计算获得与之共表达的编码基因，用clusterprofile软件计算每个TF条目中差异gene富集的显著性。计算的结果会返回一个富集显著性的p值，小的p值表示差异gene在该TF条目中出现了富集，对每一个lncRNA富集结果，挑选富集程度较高的前20条目绘制气泡图，X轴Enrichment Score为富集分值，气泡大小代表差异基因的数量，越大代表基因数量越多，气泡颜色按紫-蓝-绿-红变化，其富集pvalue值越小，显著程度越大。

案例展示
案例一  先天性肛门直肠畸形中长链非编码RNA的研究

研究背景

先天性肛门直肠畸形（ARMs）是较常见的新生儿消化道畸形，其种类繁多，病理复杂，不仅肛门直肠本身发育缺陷，肛门周围肌肉、耻骨直肠肌、肛门外括约肌和内括约肌均有不同程度的改变，在新生儿中的发病率为1：1500～5000，占消化道畸形的首位。该畸形一般为会引起神经系统变化和其他器官畸形等多发型畸形或者是严重危及病儿生命的畸形。目前该畸形的分子机制还不是很清楚，一般认为遗传和环境因素都有可能是发病因素。本着早发现早治疗的原则，目前没有更好的预防和诊断方法。所以，预防和治疗ARMs的关键问题是阐明基因调控和胚胎畸形的机制。

研究结果与内容

作者选择ETU（ethylenethiourea）喂食妊娠期小鼠获得其体内致病胎儿的末端肠组织作为实验材料。经过芯片检测ARM与对照组的lncRNA和mRNA的表达情况。常规分析获得ARMs versus control差异lncRNA和差异mRNA的结果，以及差异mRNA的功能富集结果。后续的lncRNA高级分析，获得lncRNA与mRNA共表达的网络图，以及lncRNA所在染色体位置上下游300kb范围内的mRNA的结果统计分析，即cis分析。而lncRNA与其所在染色体位置300kb以外的mRNA之间的调控作用可能通过转录因子，所以经过trans分析获得lncRNA、TF、mRNA三者之间的关系对。

                cis分析结果                                                                  trans分析网络图

参考文献
Hui Xiao, Rui Huang, Long Chen, et al. Integrating lncRNAs and mRNAs expression profiles in terminal hindgut of fetal rats with anorectal malformations. Pediatric Surgery International .2018,34:971–982. (IF1.476)

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