提供商:         上海研谨生物
服务名称:       PKC活性检测实验
规格:           实验服务
价格：          200元
收费标准/服务周期/提供结果:
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PKC活性检测实验

实验试剂: 琼脂糖(Promega公司，V3125) ;其他常备试剂购自sigma公司; PKC活性检测试剂盒(Promega公司，V5330)
实验仪器:电泳仪(北京六一厂，112-0640) ;水平电泳槽(北京六一厂，122-3146) ;电热恒温培养箱(碧云天生物，EBI025) ;电热恒温水浴锅(江苏省金坛市环宇科学仪器厂，HH-8)
基本原理:分离PKC蛋白(磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白)，利用试剂盒组分将2种蛋白分离并加以区分,利用电泳琼脂糖凝胶技术显示2种不同的蛋白，利用分析软件将显示的不同蛋白定量并加以比较，以磷酸化PKC非磷酸化PKC灰度值IOD的比值显示PKC活性(PKC活化度)。

操作步骤:
1.用预冷的匀浆器把细胞匀浆。
2.在4°C，用14,000 xg离心裂解液5分钟，保存上清。
3.用PKC抽提液预平衡1ml的DEAE纤维素柱，再把第2步中得到的上清过柱。用5m的PKC抽提液洗柱子，然后用5ml含有200mM NaCI的PKC抽提液洗脱含有PKC的组分。
4.用PKC稀释液(PKC dilution buffer)将少量蛋白激酶C (Promtein Kinase C)稀释到2 .5ug/ml.随试剂盒所附的产品信息中标有这个酶的初始浓度。
5.用探头超声波破碎仪超声处理PKC Activator Solution 20-30秒,或直到溶液变温暖。
6.对每一个样品，按照下面所列顺序在0.5ml小离心管中混合PepTag@ PKC 5x Buffer,PepTag@ C1Peptide,超声过的PKC Activator 5X Solution,和水。在样品加入之前，小离心管--直要放在冰上。阴性对照将用于对反应进行定量时确定其摩尔吸收值(说明书第IV部分) 。

标准PKC检测
PepTag@ PKC Reaction 5X Buffer           5ul
PepTag@ C1 Peptide (0.4ug/ul)            5ul
PKC Activator 5X Solution,超声处理的      5ul
短肽保护液(非必须)                    1ul
样品                                 9ul
去离子水使终体积为                   25ul

PKC阳性对照检测
PepTag⑧PKC Reaction 5X Buffer          5ul
PepTag@ C1 Peptide (0 4ug/ul)           5ul
PKC Activator 5XSolution,超声处理的      5ul
短肽保护液(非必须)                   1ul
Protein Kinase C (2.5ug/ml溶于PKC dilution bufer)     4ul
去离子水使终体积为                  25ul

PKC阴性对照检测(不加PKC)
PepTag@ PKC Reaction 5X Buffer         5ul
PepTag@ C1 Peptide (0 4ug/ul)          5ul
PKC Activator 5XSolution,超声处理的     5ul
短肽保护液(非必须)                  1ul
去离子水使终体积为               25ul

7.在0时间点，把--支管子从冰上移到30°C水浴中孵育2分钟。然后加入样品或蛋白激酶C在30°C再孵育30分钟。
8.把管子放进开水浴或95°C加热块10分钟以终止反应。在凝胶电泳前把样品--直避光存放在4°C或-20°C。
9.把样品上样到胶上之前，往每个样品中加进1ul的80%甘油，以确保样品保留在上样孔中(说明书第II.F部分)。
10.每孔点样10ul,在0. 8%琼脂糖凝胶上以100V电泳15分钟分开样品，拍照。

检测结果:
说明:后面2组泳道“阳性(PC)"和“阴性(NC)"为试剂盒自带系统对照。
注:阳性条带以Gel pro4版凝胶光密度分析软件进行分析,测其IOD (integrated optical density)累积光密度参考值。按照百分比例计算PKC活性百分比
(以阳性对照I0D值为100，其余各组的PKC+ p-PKC总和为100分配IOD数值)

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注：该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案，不可用于临床诊断或治疗等相关用途