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参考报价: | 面议 | 型号: | 流式细胞术检测细胞焦亡 |
品牌: | 博恩生物 | 产地: | 南京 |
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样本: | 暂无样本 | 典型用户: | 暂无 |
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一、细胞焦亡介绍
细胞焦亡(pyroptosis)是一种最近发现的细胞程序性死亡方式,表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂,导致细胞
内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。自2015年以来,邵峰院士等人发现,caspase-1和caspase-11/4/5是通过
切割一个叫做Gasdermin-D(GSDMD)的蛋白而诱发细胞焦亡的,GSDMD在被caspase-1或caspase-11/4/5切
割后,释放出其N端结构域,该结构域具有结合膜脂并在细胞膜上打孔的活性,这样就导致细胞渗透压的变化而发
生胀大直至最终细胞膜的破裂(Shi et al., Nature 2015;Ding et al., Nature 2016)。细胞焦亡是机体重要天然
免疫反应,在拮抗感染和内源危险信号中发挥重要作用。细胞焦亡广泛参与感染性疾病、神经系统相关疾病性疾病
等的发生发展,对细胞焦亡的深入研究有助于认识其在相关疾病发生发展和转归中的作用,为临床防治提供新思路。
近几年,细胞焦亡的研究热度迅猛上升,已成功吸引科学家们的眼球,一跃成为热门研究领域。
细胞焦亡(pyroptosis)、细胞凋亡(apoptosis)、细胞自噬(autophagy)、细胞坏死性凋亡(necroptosis)都
是程序性死亡(Programmed Cell Death, PCD)的表现形式,程序性细胞死亡是指细胞接受某种信号或受到某些
因素刺激后,为了维持内环境稳定而发生的一种主动性消亡过程。细胞凋亡由凋亡性caspase(Caspase-2, 3, 6, 7,
8, 9或人类caspase-10)介导。与细胞凋亡相比,细胞焦亡是由炎症性caspase(Caspase-1, 4, 5, 11)诱导的一
类坏死性和炎症性的细胞程序性死亡。相比于细胞凋亡,细胞焦亡发生的更快,并会伴随着大量促炎症因子的释放。
由于细胞焦亡需要炎症性caspase的参与,其与另一种坏死性和炎症性的细胞程序性死亡方式—坏死性凋亡不一样,
坏死性凋亡发生不需要caspase的参与。
细胞焦亡与其它程序性死亡和非程序性死亡的差异 :
二、细胞焦亡的特点
细胞焦亡发生时,细胞会发生肿胀,在细胞破裂之前,细胞上形成凸出物(图1,细胞焦亡Early),之后细胞膜上形
成孔隙,使细胞膜失去完整性,释放内容物,引起炎症反应,此时,细胞核位于细胞中央(图1,细胞焦亡Late),
随着形态学的改变,细胞核固缩,DNA断裂。
细胞焦亡过程,具有caspase-1依赖性。在外界条件的刺激下,caspase-1前体可以与模式识别受体NLRP1、NLRP3
等通过接头蛋白ASC变为一个高分子复合物,即炎症小体,也称依赖caspase-1的炎症小体。细胞在caspase-1激活
同时会释放出炎性因子白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)和IL-18,进而吸引更多的炎性细胞,加重炎症反应。
焦亡发生时形成孔隙,它允许细胞质的内容物,如乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)和炎性细胞因子释放,
荧光标记的膜联蛋白V、7-氨基放线菌D或碘化丙啶进入细胞。
三、细胞焦亡的信号通路
细胞焦亡属于炎症性死亡途径,按激活机制,可分为Caspase-1依赖和不依赖两种途径。两种途径都是通过切割
GSDMD后形成N端游离的肽段,这一肽段会诱导细胞形成孔道并导致细胞破裂,释放胞质成分。两种途径都能同
时诱导IL-1β和IL-18的前体进行切割,形成成熟的IL-1β和IL-18。不同的只是是否直接激活Caspase-1。
炎性小体激活的分子机制与焦亡的诱导发生需要两步机制:第一步是启动步骤,促炎因子如 proIL-1β、Nlrp3和caspase-11等
的转录生成。第二步是激活炎性复合物,炎性复合物包括NLR(NOD-like receptors,胞浆内感受器)蛋白家族成员、衔接蛋
白ASC/TMS1和Pro-Caspase-1,其中NLR蛋白家族成员中NLRP3是细胞焦亡中的主要炎性复合物。
(1)细胞焦亡发生的经典通路:在病原体、细菌等信号的刺激下,细胞内的NLR识别这些信号,通过衔接蛋白ASC与
Pro-Caspase-1结合,激活Caspase-1,活化的Caspase-1一方面切割GasderminD,形成GasderminD氮端和碳端,
GasderminD氮端就会和细胞膜上的磷脂蛋白结合,形成孔洞,释放内容物,诱导焦亡发生;另一方面,活化的Caspase-1
对IL-1β和IL-18的前体进行切割,形成有活性的IL-1β和IL-18,并释放到胞外,造成炎症反应;
(2)依赖Caspase-4、5、11的非经典途径:以炎性刺激因子LPS为例,没有通过受体直接进入细胞质内,Caspase 其它家族
成员如Caspase-4、5、11被活化,活化的Caspase-4、5、11切割GasderminD,诱导焦亡发生;另一方面,诱导Caspase-1
的活化,对IL-1β和IL-18的前体进行切割,造成炎症反应。
四、细胞焦亡的研究方法
细胞焦亡的机制中GSDMD的切割,IL-1β和IL-18前体的切割成熟和释放是关键信号,因此证明所诱发的细胞死亡方式是否为
细胞焦亡,需要几个关键的实验证据:
(1) GSDMD的切割 (Western检测);
(2) Caspase的激活,主要是Caspase-1,Caspase-4,Caspase-5,Caspase-11。(Western检测);
(3) IL-1β和IL-18前体的切割成熟和释放 (Western,ELISA等);
(4)细胞形态学检测(CCK-8等);
(5)染色质完整性检测 (Tunel等)。
五、完整检测方式如下:
1、形态变化
1)扫描电镜观察细胞形态;
2)免疫荧光染色(GSDMD/GSDME);
3)Tunel检测;
2、检测焦亡相关基因及蛋白
1)Western Blot方法检测焦亡相关基因或蛋白的表达水平(例如,Caspase-1、4、5、11;GSDMD;
Cleaved Caspase-3、IL-1β、IL-18、NLRP3、ASC等)
2)ELISA试剂盒检测炎症因子的水平;
3)CCK8法测定细胞活力;
4)免疫组化检测组织蛋白的表达
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