EMSA实验为常规转录因子研究技术手段，主要用于研究转录因子与启动子结合。

通过分段构建探针还可以用于研究结合位点。

通常与荧光素酶报告基因、ChIP搭配或单独应用。

1、凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）的引用：

（1）研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用；

（2）可用于DNA定性和定量分析；

（3）用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

2、实验原理

一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA

结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复

合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不

同，可是双链或者是单链。当检测 如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽

提液。

在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。

竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异）， 和其它非相关的片段（非特异），来确

定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

3、实验步骤

一、探针的标记

1. 如下设置探针标记的反应体系：

（1）待标记探针 (1.75 pmol/微升) ：2微升。

（2）T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) ：1微升。

（3）Nuclease-Free Water ：5微升。

（4）[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) ：1微升。

（5）T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升) ：1微升。

（6）总体积 10微升

（7）按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混匀。

2. 使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟。

3. 加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。

4. 再加入89微升TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上，即总放射性的

30%以上标 记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。

5. 标记好的探针******立即使用，******使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。

4、 探针的纯化

通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化

，可以按照如 下步骤操作：

1. 对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5 M醋酸铵，再加入2体积即200微升的无水乙醇，混匀。

2. 在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。

3. 在4℃，12 000 g-16 000 g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉。

4. 在4℃，12 000 g-16 000 g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。

5. 加入100微升TE，完全溶解沉淀。标记好的探针尽量立即使用，使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针

可以保存在 -20℃。

5、EMSA 胶的配制

1. 准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。选择可以灌制较薄胶的模

具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大 EMSA 胶的模具。

2. 按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。

（1）TBE buffer (10X)： 1毫升。

重蒸水 16.2毫升。

（2）39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)： 2毫升。

（3）80% 甘油： 625微升。

（4）10% 过硫酸铵 (ammonium persulfate) ：150微升。

（5）TEMED ：10微升

3. 按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避

免产生气泡， 并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。

6、EMSA结合反应

1. 如下设置EMSA结合反应

阴性对照反应：

  (1）Nuclease-Free Water ：7微升。

（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。

（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子： 0微升。

（4）标记好的探针 ：1微升。

（5）总体积 ：10微升。

样品反应：

（1）Nuclease-Free Water ：5微升。

（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。

（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子 ：2微升。

（4）标记好的探针： 1微升。

（5）总体积： 10微升。

探针冷竞争反应：

（1）Nuclease-Free Water ：4微升。

（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。

（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子： 2微升。

（4）未标记的探针： 1微升。

（5）标记好的探针： 1微升。

（6）总体积 ：10微升。

突变探针的冷竞争反应：

（1）Nuclease-Free Water ：4微升。

（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。

（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子 ：2微升。

（4）未标记的突变探针： 1微升。

（5）标记好的探针： 1微升。

（6）体积 ：10微升

Super-shift反应：

（1）Nuclease-Free Water：4微升。

（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。

（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子：2微升。

（4）目的蛋白特异抗体 ：1微升。

（5）标记好的探针：1微升。

（6）总体积 ：10微升。

2. 按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25℃)放置10分钟，从而消除可能发

生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25℃)放置20分钟。

3. 加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的

结合，建 议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可

以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可。

7、 电泳分析

1. 用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释

好的1X 的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。

2. 把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样

缓冲液 (蓝色)，用于观察电泳进行的情况。

3. 按照10 V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift

上样缓 冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。

4. 剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板，用吸水纸或普通草纸大致

擦干胶板边 缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(注：通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板)，把滤纸从EMSA

胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶，轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟)，轻轻揭起滤纸，这时

EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下，放平，在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。

5. 干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测，或用其它适当仪器设备检测。

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注：该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案，不可用于临床诊断或治疗等相关用途