RNA pull-down实验原理

RNA pull-down是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。使用体外转录法标记生物素RNA

探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育

液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过western blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。质谱实验

检测特定的RNA结合蛋白鉴定蛋白质类型。

RNA pull-down实验技术流程

（1）目标RNA的制备及生物素标记。

目标RNA制备的一般流程包括：

构建RNA过表达质粒：基因合成+测序验证

体外转录模板准备：设计含T7启动子引物；PCR扩增得到转录模板

体外转录：以PCR产物为模板，体外转录得到目的RNA

（2）磁珠富集RNA

（3）RNA结合蛋白孵育

（4）RNA结合蛋白洗脱，银染质检：SDS-PAGE电泳银染检测富集蛋白的情况

（5）WB或者MS检测

ChIP、RIP、RNA pull-down、EMSA、荧光素酶报告基因的比较

ChIP：通过与染色质片段共沉淀和PCR技术，在体内检测与特异蛋白质结合的DNA片段。将处于适当生长时期

的活细胞用甲醛交联后将细胞裂解, 染色体分离并打碎为一定大小的片段200bp-1000bp;然后用特异性抗体免

疫沉淀目标蛋白与 DNA交联的复合物, 对特定靶蛋白与DNA片段进行富集。采用低pH值条件反交联, DNA与蛋

白质之间的 Schiff键水解, 释放DNA片段。通过对目标片段的纯化与检测,获得DNA与蛋白质相互作用的序列信息。 

研究目的：蛋白与DNA结合情况。

RIP：RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀），是研究细胞内RNA

与蛋白结合情况的技术。运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以

对结合在复合物上的RNA进行分析；即用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白，防

止非特异性的RNA的结合，免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来，结合的RNA序列通过

microarray （RIP-Chip），定量RT-PCR或高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定。是了解转录后调控网络动态过

程的有力工具，能帮助我们发现miRNA的调节靶点。 

研究目的：蛋白与RNA结合情况。

RNA pull-down：使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。

该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过western blot

实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。

研究目的：蛋白与RNA结合情况。

EMSA：凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白

和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用、DNA

定性和定量分析。生物素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。

研究目的：蛋白与DNA结合情况。

荧光素酶报告基因：荧光素酶的基因可以被合成并插入到生物体中或转染到细胞中，将不同类型的细胞（骨髓干

细胞、T细胞等）标记上（即表达）荧光素酶，就可以用高敏感度的CCD相机进行对动物体内进行活体观察而不

会伤害到动物本身。在荧光素酶中加入正确的萤光素底物就可以放出荧光，而发出的光子可以被光敏感元件，如

萤光探测器或改进后的光学显微镜探测到。这就使得对包括感染在内的多种生命活动进程进行观察成为可能。

研究目的：启动子激活情况。

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