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参考报价: | 面议 | 型号: | 细胞自噬 |
品牌: | 鹰旸生物 | 产地: | 浙江 |
关注度: | 暂无 | 信息完整度: | |
样本: | 暂无样本 | 典型用户: | 暂无 |
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服务描述:
细胞自噬(autophagy or autophagocytosis):又称为Ⅱ型细胞死亡,是细胞在自噬相关基因(autophagyrelated gene,Atg)的调控下利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程。
细胞经诱导或抑制后,需对自噬过程进行观察和检测,常用的策略和技术有:
1、观察自噬体的形成
由于自噬体属于亚细胞结构,普通光镜下看不到,因此,直接观察自噬体需在透射电镜下。phagophore的特征为:新月状或杯状,双层或多层膜,有包绕胞浆成分的趋势。自噬体(AV1)的特征为:双层或多层膜的液泡状结构,内含胞浆成分,如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(AV2)的特征为:单层膜,胞浆成分已降解。(autophagic vacuole,AV)
2、在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成
由于电镜耗时长,不利于监测(Monitoring)自噬形成,人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时,GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中;自噬形成时,GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜,在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点,一个斑点相当于一个自噬体,可以通过计数来评价自噬活性的高低。
3、利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成自噬形成时,胞浆型LC3(即LC3-I)会酶解掉一小段多肽,转变为(自噬体)膜型(即LC3-II),因此,LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。(注意:LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力,会造成假阳性。方法2和3需结合使用,同时需考虑溶酶体活性的影响。)
4、检测长寿蛋白的批量降解:非特异
5、MDC(Monodansylcadaverine,单丹磺酰尸胺)染色:包括自噬体,所有酸性液泡都被染色,故属于非特异性的。
6、CellTrackerTM Green染色:主要用于双染色,但其能染所有的液泡,故也属于非特异性的。
细胞自噬实验步骤:
自噬的过程分为4步:1)细胞接受自噬诱导信号后,在胞浆的某处形成一个小的类似"脂质体"样的膜结构,然后不断扩张,被称为Phagophore。
2)Phagophore不断延伸,将胞浆中的任何成分,全部揽入,然后"收口",成为密闭的球状的autophagosome,即"自噬体"。
3)自噬体形成后,可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合(这种情况不是必然要发生的)。
4)自噬体与溶酶体融合形成autolysosome,期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解,2者的内容物合为一体,自噬体中的"货物"也被降解,产物(氨基酸、脂肪酸等)被输送到胞浆中,供细胞重新利用,而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。
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注:该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案,不可用于临床诊断或治疗等相关用途