mall RNA修饰高通量筛选面临的挑战及解决方案

       尽管测序已用于small RNA高通量筛选，但RNA修饰对测序定量的影响仍被严重忽视。RNA上多种修饰（m1A，m3C和m1G等）会干扰测序建库过程中的逆转录，因此small RNA-seq对small RNA修饰的定量是不准确的，特别是对small RNA上的修饰。 例如，Small RNA-seq大多偏向检测18nt的3’tsRNA，而Northern blot主要检测到的是22nt的同工型3’tsRNA。这是由于TUC存在m1A，会抑制逆转录酶进行逆转录。大多数small RNA测序数据是从上述文库构建方法中获得的，因此，对于有修饰的small RNA，这些数据可能产生误导。

       同样，small RNA-seq需要多个PCR扩增步骤，这会导致明显的定量偏差及不准确，因此需要使用独立正交方法。

       事实上，研究修饰的测序方法需要大量的样本（总RNA> 100 ug），这样对样本量有限的研究会产生极大的限制。

       此外，small RNA测序通常使用Reads Per Million（RPM）进行标准化，来表示样品中RNA的相对丰度。 然而，RPM取决于样品中small RNA的组成。 一个small RNA的RPM的变化将影响所有其它small RNA的值，即使它们的绝对表达水平没有改变。

       因此，就需要克服基于测序方法的局限，开发非测序技术，以更高的灵敏度和准确性来鉴定和定量small RNA的修饰谱。

定量small RNA转录后修饰的技术

Arraystar small RNA修饰芯片技术（图1）将small RNA芯片与RNA免疫沉淀（RIP）进行整合，可在一张芯片上同时检测修饰及未修饰small RNA水平，为修饰对small RNA（包括miRNA，pre-miRNA和tRF＆tiRNA）的调控提供重要信息，

图1. Arraystar small RNA修饰芯片技术，分别鉴定和定量small RNA转录后修饰，分别为o8G，m7G，m6A，Ψ和m5C。使用特异性抗体通过免疫沉淀富集修饰的small RNA后，使用Arraystar small RNA修饰芯片进行鉴定和定量。

数据库
Arraystar  Human small RNA 修饰芯片 V1.0

结果展示
数据分析包括可直接使用的关键数据、丰富的注释信息和出版级别的图形。

差异修饰small RNA列表，包括miRNA，pre-miRNA和tsRNA（tRF＆tiRNA）

MatureID:  成熟miRNA在miRBase 的ID

Group m7G miRNA level (normalized, log2): 基于Cy5标记的m7G-IP RNA的初始信号值得到的log2转换的标准化后的组平均值。

Treated, Control:  实验组和对照组

FC:  两组比较的差异倍数

P:  t test检验分析的统计学差异的p值

Regulation: 两组比较的上调或者下调

Group m7G %modified miRNA: m7G修饰的miRNA组平均百分比

miRNA_family: 具有相同的种子序列的miRNA家族

m7G_motif: “RAm7GGT” m7G 的motif基序, R 代表G或A

差异修饰的miRNA，pre-miRNA和tsRNA（tRF＆tiRNA）的分层聚类热图

图1.差异修饰small RNA的分层聚类热图。 修饰的RNA水平由左上方小图中红蓝色色标表示。顶部树状图显示了样品之间修饰图谱相对接近度。组别由热图上方的色条表示。

相关技术服务：
Arraystar Small RNA修饰芯片