逆行跨单突触狂犬病毒（RV）

一、原理及应用介绍

     RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒属（Lyssavirus）的单股负链RNA病毒。RV感染中枢系统后，主要标记神经元，几乎不标记胶质细胞；被感染的神经元在一定时间内（7-12天）几乎不发生明显病变及裂解。基于RV疫苗株Sad-B19感染性克隆构建的复制缺陷型重组RV具有较低的毒性和较高的安全性，可清晰的标记神经元的精细形态，并通过反向互补策略实现了对神经网络连接的逆向跨单级突触追踪。

     RV的囊膜糖蛋白（glycopro-tein，G）是其逆行跨突触所必需的蛋白，其受体大量分布在轴突末端，感染后可沿轴突逆行进入神经元胞体开启病毒复制，G蛋白缺失的RV（RV-ΔG）会丧失跨突触能力，而其复制及转录不受影响（可持续高丰度表达外源基因），因此，RV-ΔG携带报告基因后，其功能类似CTB，retrobeads等，可逆向高亮度标记神经元精细形态。另外，补偿RV-G蛋白，可辅助RV-ΔG逆行跨突触感染上一级神经元，从而实现跨单突触神经网络标记。利用重组的禽类肉瘤病毒的外膜蛋白（EnvA）融合蛋白包装RV形成的病毒粒子，可特异性识别EnvA的受体TVA（TVA只存在于禽类细胞中，在哺乳动物神经元中无表达）介导病毒特异性地感染细胞。利用Cre转基因鼠结合Cre-LoxP控制表达TVA及G蛋白的AAV辅助病毒，可实现只在特定区域特异类型神经元中表达TVA及G蛋白，从而利用RV-EnvA-ΔG实现对特异类型神经元的逆向跨单级突触标记。

图1. A:跨单级RV改造原理；B:RV逆行跨单级突触标记示意图

(Arenkiel BR et al.Nature.2009.)

应用案例

案例1 RV-EnvA-EGFP标记

图2. RV-EnvA-EGFP标记效果图

RV-EnvA-ΔG-EGFP注射位点NAC（A）；AAV-DIO-BFP-TVA和AAV-DIO-RVG注射位点NAC（B）；注射位点NAC Merge（C）；逆向跨单突触区域丘脑室旁核PVA（D）；逆向跨单突触区域腹侧海马VHPC（E）；逆向跨单突触区域基底外侧杏仁核后部BLP（F）（Figure provided by Dr.Fuqiang Xu's lab of Center for Brain Science at WIPM）

案例2 RV-DG-EGFP标记

图3. RV-DG-EGFP标记效果图

注射位点为腹侧被盖区VTA（A）；逆向投射区域分别为纹状体Cpu（B），伏隔核Acb（C），内侧僵核MHb和外侧僵核LHb（D），背缝核DR（E）和上丘SC（F）（Figure provided by Dr.Fuqiang Xu's lab of Center for Brain Science at WIPM）

案例3 RV-N2C(G)-DG-XFP标记

图4. RV-N2C(G)-DG-XFP标记效果图

C57小鼠病毒注射后1W灌流。A，B，C，D为逆向标记的4个不同脑区的图像采集信息。测试显示，a)注射位点细胞荧光蛋白高表达且无明显炎症反应；b)可逆向标记多个区域；c)逆向投射效率高，标记细胞形态较好，纤维高亮。

二、病毒载体制备及包装服务

     枢密科技现有RV-CVS株及SAD-B19株，其中新型RV-CVS株具以下特性：更低的神经毒性，更轻微的神经损伤，更高效的标记效率；感染时间延长至一个月；可结合光遗传、钙成像、Cre、Flp等技术实现脑网络特异性功能研究及基因表达调控。

图5. RV-CVS株表达效果 （Thomas R.Reardon,Neuron,2016）

病毒工具列表

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