实验原理

        荧光素酶报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测荧光素酶活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪（化学发光仪）测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。

        双荧光素酶体系，即有两种荧光素酶，比较常见的组合是萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶，萤火虫荧光素酶作用于甲虫荧光素，而海肾荧光素酶在氧的存在下作用于海肾荧光素。以其中一个作为内参对照，即表达量基本恒定，用于减少试验中不同处理间所固有的变化，包括培养细胞的数目及活力的差异，细胞转染及裂解的效率，而另外一个荧光素酶则作为报告基因，用于指示不同处理条件下基因的表达情况。 

实验应用： 

潜在启动子/启动子核心区域检测； 

潜在增强子/抑制子等调控子核心元件检测； 

启动子区可能的转录因子结合位点检测； 

启动子/增强子与转录因子的相互作用； 

病毒/细胞相互作用； 

药物等化学诱导因素对启动子活性的调节（抑制或增强）； 

射线等物理诱导因素对启动子活性的调节（抑制或增强）； 

microRNA靶基因验证。 

以双荧光素酶实验进行microRNA靶基因验证为例，介绍相关的实验流程。

应用举例

A. 启动子区转录因子验证

    转录因子主要通过作用于靶基因的启动子起作用，将目的基因启动子区序列替换报告基因F-Luc的启动子，通过共表达转录因子后，报告基因表达的改变，来确定转录因子与靶基因启动子结合位点及对靶基因的作用。

B. MiRNA靶基因验证

    MiRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用（降解或抑制靶基因翻译），实验将目的基因3’UTR（野生型和结合位点突变型）序列构建至载体报告基因萤火虫荧光素酶的3’端，通过比较过表达miRNA后，报告基因表达的改变（萤光素酶的活性变化），来确定miRNA在其靶基因3’UTR区是否存在结合位点。

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