焦磷酸测序服务（PyroMark）

Pyromark焦磷酸测序——独特的定量序列分析技术，DNA甲基化分析金标准
基于定量结果对基因表达谱复杂的DNA修饰情况进行分析。焦磷酸测序是针对序列的检测技术，能够快速精确地对序列变异进行定量。简化的操作步骤、分析的灵活性和理想的输出数据使焦磷酸测序技术成为一种高度适用于广泛的学科研究的工具。

焦磷酸测序原理
步骤1
扩增DNA片段并对焦磷酸模板链进行生物素化。通过变性，分离生物素化的单链PCR扩增子并使其与一条测序引物进行杂交。
步骤2
将杂交引物和单链模板与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和腺苷三磷酸双磷酸酶，以及底物APS和荧光素共孵育。
步骤3
第一个脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)被引入反应。DNA聚合酶催化dNTP，使其在互补模板链的情况下对测序引物进行延伸。每个核苷酸的添加都对应着等摩尔数焦磷酸(PPi)的释放。
步骤4
ATP硫酸化酶在APS存在的情况下将PPi转化为ATP。生成的ATP为荧光素酶介导的荧光素氧化反应提供能量，并生成与ATP的数量成比例的可见光。电荷耦合器(CCD)摄像头检测到荧光素酶催化反应所生成的光，并将其作为原始输出数据中的一个峰值（热解图Pyrogram）。每个峰值（光信号）的高度与核苷酸结合的数目呈比例关系。
步骤5
腺苷三磷酸双磷酸酶是核苷酸的降解酶，持续地对未结合的核苷酸和ATP进行分解。当分解完成时，便会引入另一个核苷酸。
步骤6
dNTP的添加反应在持续进行着。应注意脱氧腺苷三磷酸α-硫代三磷酸（dATPαS）能够作者为天然脱氧腺苷三磷酸（dATP）的替代物，被DNA聚合酶有效利用，却并不会被荧光素酶所识别。当反应进行时，逐渐合成了互补的DNA链，其核苷酸序列能够凭借热解图（Pyrogram）轨迹中的信号峰值。

QIAGEN PyroMark定量遗传分析系统检测项目：

1、特异位点甲基化分析

     读长：50bp-100bp，根据试验需求提供多种选择

     检测全面性：可检测更多复杂特殊结构，比Sanger测序更可靠

     可靠性：10年检测经验，检测样品反应数十万例

2、SNP检测分析

     微量检测：即使样本珍贵，也可进行全面分析，上样量仅需普通检测模式的25%

     低频突变检测：可检测低至2-3%的低频突变

送样要求：

1、DNA样本：总量大于2μg，体积≤30μl；OD260/280=1.7-2.0, OD260/230≥1.4；琼脂糖电泳检测条带大于10kbp，条带单一，无RNA或蛋白污染。

2、全血样本：样本体积≥2ml。推荐使用EDTA抗凝，避免肝素抗凝剂的使用

3、组织样本：质量大于50mg；单个组织块不大于30mg

4、FFPE样本：10张以上未经染色的切片，面积大于100mm²，厚度介于5-10μm。