CRISPR/Cas9基因编辑技术服务

北京孚博生物提供CRISPR/Cas9基因编辑技术服务。

CRISPR/Cas9服务项目主要包括：
gRNA合成服务
CRISPR/Cas9载体构建
Cas9载体活性验证
CRISPR基因敲除细胞株构建
CRISPR基因敲入细胞株构建

CRISPR/Cas9技术简介

CRISPR(clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前，来自Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。研究人员为了将CRISPR/Cas9技术发展为高效的基因打靶工具，又进行了优化和改造。Cong, L.等人在不影响系统效率的情况下，将crRNA和tracrRNA融合为一条RNA。通过这种简化，CRISPR/Cas9系统现仅包括两个元素：Cas9蛋白和sgRNA（single guide RNA）。因此现在人们将CRISPR/Cas9技术也称为Cas9/sgRNA技术。
CRISPR/Cas9通过对预设的DNA位点进行切割，造成DNA双链断裂（DSB, double strand break）。这种DNA的损伤可以启动细胞内的修复机制，主要包括两种途径：①是低保真性的非同源末端连接途径（NHEJ，Non-homologous end joining），此修复机制非常容易发生错误，导致修复后发生碱基的缺失或插入（Indel），从而造成移码突变，最终达到基因敲除的目的。NHEJ是细胞内主要的DNA断裂损伤修复机制。利用靶向核酸酶可以在受精卵水平高效的实现移码突变，从而制备基因敲除模式动物。CRISPR/Cas9技术的出现，使得无需再使用相应物种的ES细胞系就可以制备基因敲除模式生物，且已成功应用于小鼠、大鼠、猪、灵长类、果蝇等等。②DNA断裂修复途径为同源介导的修复（HR, homology-directedrepair），这种基于同源重组的修复机制保真性高，但是发生概率低。在提供外源修复模板的情况下，靶向核酸酶对DNA的切割可以将同源重组发生的概率提高约1000倍。利用这种机制可以实现基因组的精确编辑，如：条件性基因敲除、基因敲进、基因替换、点突变等等。

到目前为止CRISPR/Cas已经运用到了各种细胞以及大肠杆菌、酿酒酵母、拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦、线虫、果蝇、蚕、斑马鱼、非洲爪蟾、小鼠、大鼠、猪、羊等，从最低等的微生物到哺乳动物的基因敲除修饰或突变，另外一方面其强大的基因组编辑能力已经用于生物治疗，如 HIV HBV等RNA病毒引起的疾病治疗研究，单基因或多基因遗传病治疗研究，癌症治疗研究等方面。 CRISPR/Cas相比其它基因组编辑技术，如锌指核酸酶（ZFNs）或转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs），操作更简单，同时更容易针对同一细胞中的多个基因位点进行编辑，该系统可成为替代目前基因组工程方法的一种更安全，毒性更低的新方法。



CRISPR技术运用

CRISPR技术可运用于各种细胞，各个物种基因敲除，敲入，修饰或突变等，另外利用失去核酸酶活的Defect Cas9与不同功能结构域融合，可以实现基因干扰，激活，染色体染色，特定DNA纯化等特殊功能。

1、基因敲除（Gene Knockout）
利用双剪切或同源重组直接移除miRNA/lncRNA基因序列或蛋白编码基因的关键外显子，使其发生移码突变，从而使靶基因功能完全丢失。

2、基因敲入（Gene Knockin）
通过基因断裂诱导的同源重组，选择性将靶基因敲入Rosa26位点（人细胞选择敲入类似基因THUMPD3-AS1），靶基因可以是小RNA，lncRNA或蛋白编码基因，条件性敲入还可实现基因表达的实时控制。

3、基因修饰/突变（Gene Modification/Mutation）
通过基因断裂诱导的同源重组，可以在原基因中插入报告基因或标签序列，实现目的基因的检测、追踪和功能研究；也可以改变原有基因的编码序列来研究其对基因功能的影响。

4、基因编辑以外的运用（Other Applications）
利用dCas9（Defect Cas9）与特殊功能蛋白结构域的融合表达，还可使其发挥特殊功能。与转录激活或转录抑制蛋白结构域的融合表达，还可实现特定基因的过表达或干扰；与荧光蛋白的融合表达，可用于染色体染色；与表面抗原的融合，可用于纯化特定基因组片段等。


CRISPR/Cas9操作步骤

1.  靶基因分析：根据靶基因的名称和种属信息，在NCBI、Ensembl Genomes或其他分子生物学网站上进行查找，搜索到该基因的信息，并明确CDS外显子部分；

2.  sgRNA位点设计：确定待敲除位点，对于蛋白编码基因，如果该蛋白具有重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。选择好要设计的区域后，再通过预测网站进行序列预测。序列预测的目的主要是避免Cas9脱靶效应，以确保设计的sgRNA尽可能的减少脱靶效应；

3.  Cas9载体构建：根据sgRNA序列，安排引物合成。引物合成时，需要在引物的5’端引入粘性末端。将引物退火形成带粘性末端的双链片段，取1ul用于后续的连接反应，其余在-20℃下保存。对表达载体先进行限制性内切酶酶切，得到线性化载体，再把前面得到的双链片段连接入表达载体。再进行感受态细胞的转化和阳性转化子的鉴定；

4.  Cas9载体活性检测：对于构建的Cas9载体，转染细胞进行重组效率的检测，检测的方法主要是采用特异性片段扩增后进行的T7E1酶切处理，这一方法可以特异、定量的检测基因组重组效率。


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