载体构建、细胞转染与分子共定位

载体构建流程：

1. 确定目的基因并设计引物（含相应酶切位点）
2. PCR扩增
3. 连接目的片段于T载体
4. 转大肠杆菌、菌落PCR验证
5. 提质粒、测序
6. 酶切并连接表达载体和测序正确的目的片段
7. 转大肠杆菌、筛选、菌落PCR等验证

       细胞转染即将外源性基因导入细胞内的一种技术。转染方法大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。该技术分为瞬时转染和稳定转染两大类。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达,但通常只持续几天；后者外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体存在，外源DNA整合到染色体中概率很小（1/104），通常需要通过一些选择性标记反复筛选以得到稳定转染的同源细胞系。

       共定位技术是一种先进的观察两个及以上的荧光标记的空间重叠的成像技术，以达到辨别不同的目标物定位于细胞的同一位置还是十分接近。该技术在很多细胞生物学和物理学研究中有重要应用。

                                                 

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