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流式细胞仪检测
样品制备，报告分析。
流式细胞以检测分析的对象是细胞或者细胞样颗粒性物质，所以流式细胞术是细胞学的重要研究手段之一下面我们介绍一下用于流式细胞仪分析的单细胞悬液。 独立细胞样品的制备 1. 如果是是悬浮细胞则直接收集细胞于离心管，离心沉淀细胞，用PBS重悬洗一次，然后固定待测，或取适量细胞与EP管中，标记相应的荧光偶联抗体，zei后吸取未结合的抗体，然后固定待测。 2. 如果细胞是贴壁细胞，需要胰酶消化细胞适当时间后，用移液器反复吹打，收集待测样品细胞，离心后固定，或标记抗体。 a． 将培养细胞用0.25%的胰蛋白酶消化，至显微镜下见到贴壁细胞回缩变圆为止，弃掉消化液，加入PBS用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，并移入离心管中。 b． 短时低速离心，即1000r/min离心5min c． 弃上清，加pH 7.4的PBS液洗2次，1000r/min离心5min，以去除细胞悬液中的细胞碎片 d． 加入固定液固定或低温保存待用。 3. 如果研究对象是外周血，根据目标细胞的不同可以有两种处理方法。如果研究对象是外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）,zei常用的提取方法是Ficoll-hypague密度梯度离心法。 Ficoll-hypague密度梯度离心法分离PBMC： a． 抽取适量的血液于离心管中，该离心管必须事先加上抗凝剂，防止血液凝固。 b． 用PBS稀释血液，稀释倍数可以根据血液的稠度加以调整，一般以2-4倍为宜。 c． 根据血液的总量选用15ml离心管或者50ml离心管，先加入离心管1/4体积的Ficoll分离液，然后慢慢将稀释后的血液小心叠加到Ficoll分离液的上层，体积是Ficoll液体积的2.5-3倍为宜。注意叠加血液时一定要轻柔，避免加入的血液与Ficoll液相混合，这一步很关键，如果血液层与Ficoll液层互相混合，就无法成功分离PBMC d． 将离心管在水平离心机中离心，2000r/min离心30min。 e． 取出离心管，此时离心管内的液体分为三层，上层为血浆，中层为含PBMC的Ficoll液，zei下层为红细胞，注意此时要轻拿轻放，切勿将分层的液体重新混匀。PBMC主要位于Ficoll液的上层，即血浆与Ficoll液层的交界处，肉眼见到的混浊絮状物就是PBMC，用吸管小心吸取中层的Ficoll液，尽量吸尽其中的混浊絮状物，吸入少量血浆不会影响结果，但需避免吸入zei下层的红细胞。 f． 将得到的含有PBMC的中层Ficoll分离液置于新的离心管中，用PBS稀释，至少稀释一倍。此PBS稀释步骤必不可少，如果不经PBS稀释直接离心，则离心时无法有效沉淀PBMC，因为PBMC密度小于Ficoll液，不稀释直接离心时PBMC仍将位于Ficoll分离液上层。 g． 低速离心10min。使PBMC沉淀，而血小板悬浮于上层液体中，弃去含有血小板的上层液体。如果血小板去除不满意，可以重复低速离心一次。 h． 用PBS重悬PBMC沉淀，1500r/min离心10min，沉淀即为PBMC。 i． 用适当的固定液固定或置低温冰箱保存。 如果研究对象是包括多核粒细胞的外周血白细胞，就不能用Ficoll-hypague密度梯度离心法，因为该法会同时去除多核粒细胞和红细胞。这时可以采取直接用红细胞裂解液裂解红细胞的方法，然后多次低速离心去除红细胞碎片即可。 收集人的外周血方法比较简单，直接静脉采血，收集于抗凝管中即可。收集小鼠的外周血zei常用的方法是眼眶取血法。 如果研究对象是胸水、腹水、脑脊液等体液内的细胞，只需直接将标本离心，PBS重悬沉淀 ，然后细胞固定或低温冰箱保存。 胸、腹水脱落细胞的制备： a．抽取胸、腹水50-100ml，加入1000U/ml肝素液1ml，放入盐水瓶置于 b．将底部10-20ml用长吸管移入试管中，用PBS液洗3次，以1500r/min离心沉淀5min c．再加入5ml PBS，用300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清 d．加固定液或低温保存 免疫器官样品制备： 免疫器官包括种属免疫器官和外周免疫器官，中枢免疫器官是免疫细胞发育的场所，主要包括骨髓和胸腺，外周免疫器官是免疫细胞发挥功能的场所，主要包括脾脏和淋巴结。免疫器官主要由免疫细胞组成，免疫细胞之间基本是互相独立的，很少形成稳定的连接，而且免疫器官内结缔组织含也比较少，所以将免疫器官制备成单细胞悬液相对比其他实体脏器容易的多。 研究小鼠的骨髓细胞一般提取长骨和股骨和胫骨内的骨髓。 骨髓单细胞悬液制备方法： a． 颈椎脱臼处死小鼠，用剪刀、镊子直接分离小鼠的股骨和胫骨。 b． 用1ml的注射器在股骨或胫骨的两端钻孔，然后用该注射器吸取培养基，反复冲洗股骨和胫骨的骨髓腔，将骨髓腔内的细胞冲洗处理。 c． 用枪头或移液管反复吹打冲洗液中的骨髓细胞，使骨髓细胞尽可能相互分离，成为单个细胞悬液。 d． 离心沉淀骨髓单细胞悬液，红细胞裂解液裂解红细胞。 e． 离心弃上清，去除红细胞碎片。 f． 用PBS重悬沉淀。 胸腺、脾脏和淋巴结内主要是相对独立的免疫细胞，制备这些脏器的单细胞悬液，只需要直接将脏器经钢网研磨即可。 胸腺、脾脏和淋巴结单细胞悬液的制备： a． 颈椎脱臼处死小鼠，分离需要制备单细胞悬液的脏器。 b． 取一干净平皿，放入无菌钢网，将脏器置于钢网上，加入适量PBS或培养基，用研磨棒轻轻研磨脏器，尽量将所有脏器组织研磨成单细胞状态，直到只剩下脏器的结缔组织为止。注意研磨时动作应轻柔，用力过大可导致细胞死亡。 c． 弃去钢网和钢网上的结缔组织，收集平皿内的细胞悬液，1000r/min 5min离心沉淀。 d． 红细胞裂解液裂解红细胞，离心去除红细胞碎片。 e． 用PBS重悬沉淀，就可以标记荧光偶联抗体，或是先细胞固定储存。 实体脏器样品制备 实体脏器如肺、肝脏和肿瘤组织内含有较多的结缔组织，实体脏器细胞之间结合紧密，所以直接研磨脏器法无法得到理想的单细胞悬液。因此，研磨前需要将脏器研磨后加入IV型胶原酶消化，消化后的组织再用研磨棒直接研磨以后的步骤与免疫器官样品制备相同。IV型胶原酶消化脏器的zei佳时间各不相同：肝脏组织较脆，结缔组织含量相对较少，一般消化0.5-1h；肺脏组织叫韧，完全消化约需3h；肿瘤组织根据组织类型的不同而异，一般需1-2h。 实体脏器研磨后的单细胞悬液以实体细胞为主，如果研究目标不是实体细胞，而是脏器内的浸润的免疫细胞，可以用Percoll密度梯度离心法富集免疫细胞，然后再进行流式分析。 在制备单细胞悬液的过程中，尤其是在制备粘连性较大的实体脏器的单细胞悬液的过程中，如人的肿瘤组织等，经常会在缓冲液中加入EDTA等阳性螯合剂以防止单个细胞再聚集。EDTA在防止单细胞再聚集方面有较好的作用，但它可能会影响实验结果，如EDTA会螯合缓冲液中的钙离子，大幅度减弱荧光素偶联的抗体CD8单抗的荧光信号，若同时加入Cacl2可有助于抵消EDTA对抗体荧光信号的影响。因此研究者应该严格比较加入EDTA组与不加EDTA组的实验结果，排除EDTA对实验结果的影响。 荧光信号是流式细胞仪接收处理的重要信号，应用荧光技术使流式细胞术发生了质的飞跃，使流式细胞术发展成为广泛应用于基础生物研究和临床诊断的技术。流式细胞仪接收到的荧光信号来源于结合在样品上的荧光素，荧光素偶联的抗体或者荧光染料与细胞结合后就会使细胞带有相应的荧光素，该荧光素被相应激光激发后产生特定的波长的荧光，分析该荧光信号的强弱就可以间接反映样品细胞的某些特征。 流式细胞术中常用荧光素列表： 荧光素 中文名 激发光波长/nm 发射光波长/nm 基本用途 FITC 异硫***酸荧光素 488 525 抗原分子检测与细胞分型 PE 藻红蛋白 488 575 抗原分子检测与细胞分型 PE-TxRed 藻红蛋白德克萨斯红 488 612 抗原分子检测与细胞分型 PerCP 多甲藻叶绿素蛋白 488 677 抗原分子检测与细胞分型 PE-Cy5 藻红蛋白-花青素5 488 670 抗原分子检测与细胞分型 PE-Cy7 藻红蛋白-花青素7 488 770 抗原分子检测与细胞分型 APC 别藻青蛋白
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