服务步骤 |
主要内容 |
交付内容 |
交付时间 |
目的基因全基因合成 |
1. 从GenBank中寻找目的蛋白的cDNA序列。
2. 根据选用的表达系统对cDNA进行密码子及mRNA二级结构的优化。
3. 合成设计好的基因序列。 |
目的基因(连接在T载体或其它常规克隆载体上)及测序报告。 |
2周 |
目的基因亚克隆到pFastBac供体质粒 |
1. 培养并抽提含有目的基因的载体质粒。
2. 将目的基因亚克隆到pFastBac供体载体上。
3. 测序验证构建质粒的准确性。
4. 通过中抽获得重组的质粒DNA。 |
正确构建的重组表达质粒,含重组质粒的DH5α菌株及测序报告。 |
2-3周 |
制备重组杆状病毒Bacmid DNA |
1. 将重组的pFastBac供体质粒转化到大肠杆菌DH10Bac感受态菌株中。
2. 通过抗生素平板筛选出含有重组Bacmid的菌株。
3. 抽提质粒获得重组的杆状病毒Bacmid DNA。 |
重组杆状病毒Bacmid DNA,含重组质粒的DH10Bac菌株 |
2周 |
转染昆虫细胞Sf-9 |
1. 利用转染试剂将重组Bacmid质粒转入昆虫细胞Sf-9。
2. 收集成熟的重组杆状病毒并检测病毒的滴度。3. 通过多次感染提高病毒的滴度,并扩增病毒数量。
4. 通过SDS-PAGE和Western-blot检测目的蛋白表达情况。 |
高滴度重组杆状病毒,病毒滴度及蛋白表达检测结果(如果转染不成功,则不收取费用。如果没有检测到目的蛋白表达,则只收取50%实验费用)。 |
3周 |
目的蛋白表达及纯化 |
1. 培养500ml昆虫细胞至对数期,然后加入适量病毒感染细胞并表达目的蛋白。
2. 收集含有目的蛋白的部分(细胞或培养上清)。
3. 通过亲和,离子交换,疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。
4. 通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制zei终产品质量。
5. 通过Western-blot验证目的蛋白正确性。
6. 可提供表达细胞株:Sf-9,Sf-9 Mimic,High Five。 |
纯化好的目的蛋白0.1~2mg及纯化报告。可按客户要求提供含纯化标签(Tag)或切除纯化标签(Tag)的zei终蛋白,纯度可达80%以上。 |
2-3周 |
目的蛋白的再加工及详细检测 |
1. 内毒素去除,除菌,冻干等进一步加工。
2. 通过HPLC,质谱等方法详细检测目的蛋白的质量。 |
加工后的终产品及相关实验和检测报告。 |
2-3周 |
大规模制备 |
按照小试工艺放大生产规模,制备客户需要的合格蛋白产品。 |
合格的目的蛋白及服务报告。 |
协商 |