1，合成原理 DNA通过固相亚***酰胺三酯法合成：溶液中的亚***酰胺单体通过缩合反应形成3′--5′***酸二酯键，连接到固相载体（CPG或树脂）上。并依次延伸，直到序列的zei后一个5′碱基连接上后合成结束。整个合成过程仪器自动完成，每个循环分为脱保护、活化、偶合、盖帽（封闭）、氧化五个步骤。 第一步：脱保护（Deblocking）:用三***（TCA）去除CPG所链核苷上的DMT保护基团，暴露5′羟基，供下一步缩合。 第二步：活化（Activation）:单体与催化剂四唑混合进入合成柱，四唑转移一个质子给3′亚***酸上二异丙胺基的N原子，质子化的氨是四唑亲核进攻的离去基团，二异丙酰胺被四唑取代，形成亚***酰胺-四唑活性中间体。 第三步：偶合（Coupling）:亚***酰胺-四唑中间体与CPG所连接的核苷酸的5′羟基发生缩合反应，缩合脱掉四唑，形成延长一个碱基的核苷酸链。 第四步：盖帽（Capping）:少量未反应（2%）的载体上的核苷酸链的5′羟基会在后续的循环中参加反应，生成少一个碱基的核苷酸链，因此需要在反应后进行封闭。常用乙酰化反应与5′羟基缩合成酯键，一般用混合乙酸酐和N-甲基咪唑等做乙酰化试剂。 第五步：氧化（Oxidation）:偶合反应形成的三价亚***键很不稳定，因此要用氧化剂——***的四氢呋喃溶液将三价***氧化成稳定的五价***。依此步骤循环，zei终得到一个全长DNA粗品 。 探针合成需要在3末端任意加一个碱基，合成结束后根据不同标记连接不同试剂。 用新鲜的浓氨水把粗品从载体上切割下来，采用适当的纯化方式去除短片段和氨基脱保护及乙基脱保护形成的盐离子。 2，纯化原理 目前惯用的纯化方式主要有4种： OPC纯化、 PAGE 纯化、脱盐纯化、 HPLC纯化，洛成除特别要求，一般都采用PAGE 纯化 利用DNA不同片段在胶中迁移率不同而分离，大片段电荷多，分子大，迁移的速度慢。等目的片段与N-片段分开后切下目的片段，80℃孵育2小时后脱盐。 优点：分离效果好，纯度能达到98-99%，可以满足测序、克隆等用。引物也很稳定。 缺点：比较费时费力，样品损失很大。 3， Taqman-MGB探针一般用于SNP检测，也用于Realtime-PCR检测，较普通Taqman探针可以使探针的长度缩短， 提高配对与非配对模板间的Tm值差异，信噪比更高；

TaqmanMGB双标记荧光探针合成价格

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