细胞周期实验

摘要： 使用Thymidine双阻断法对HeLa S3细胞进行同步化，再利用PI染色法对同步化效果进行评价。实验结果显示Thymindine双阻断法可以有效的将HeLa S3 细胞同步化在G1/S期，释放后细胞可以高效地同步释放。该实验可以为进一步深入研究不同细胞周期中特定基因的功能提供实验基础。
关键词：HeLa S3，Thymidine， 细胞同步化，PI染色法，FACS

一、 实验原理
细胞周期（cell cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。细胞周期反应了细胞增殖速度。单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期测定细胞周期的方法很多，zei常用的是PI渗入测定细胞周期。PI，即***化丙锭，可以与细胞内DNA 和RNA 结合，采用RNA酶将RNA消化后，通过流式细胞术检测到的与DNA 结合的PI 的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA 含量不同，通常正常细胞的 G0/G1 期具有二倍体细胞的DNA 含量(2N) ，而G2/ M 期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N) ，而S 期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此，通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA 含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为 G0/G1 期，S 期和G2/ M 期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率。

二、 实验目的
使用Thymidine双阻断法对HeLa S3细胞进行同步化，再利用PI染色法结合流式细胞术对同步化效果进行评价。

三、 实验步骤
实验共分以下4个主要步骤：
1. 细胞铺盘：
HeLa S3细胞，密度为80%左右分盘， 使铺盘密度在50%左右，为满足流式细胞仪上机要求，细胞数目需大于1×106/组。
2. 细胞同步化处理：
1) 加入终浓度2mM的Thymidine同步化18h。
2) 用温育的PBS洗4次， 更换新鲜培养基，培养9h。
3) 再加入2mM Thymidine再次同步化18h。
3. 样品收集：
1) 分别收取释放2h(S期)，6h(G2/M期)和12h(G1期)细胞样品。
2) 每个样品收取都使用预冷的PBS洗涤4次，1000g离心5min，弃上清。
3) 100μl PBS重悬沉淀，吸取出细胞悬液于移液器中，于移去细胞的管中加入900μl预冷的70%乙醇，漩涡振荡器震荡中滴入细胞悬
液。
4) 4℃固定一小时或更长时间。
5) 1500rpm，离心10min，去固定液。
6) 细胞染色液配制：50×RNase A 母液：50×PI母液：PBS=20：20：960；RNase A 母液浓度1mg/ml，工作浓度20μg/ml；PI母液浓度2.5mg/ml，工作浓度50μg/ml。
7) 37℃染色1h。根据细胞量，加入一定体积的细胞染色液（1~1.5ml）重悬，使上机时细胞通过率为200~350Cell/s，染色液不可过多或过少，过多则细胞密度过低上机速度严重不足，过少则导致细胞粘结。
8) 300目筛网过滤至流式管中。
4. 上机检测：
流式细胞仪上机检测，计数50000个细胞。
5. 同步化数据分析：
数据使用ModFit软件分析。

四、 实验结果

                                                                                   图1. HeLa S3细胞同步化结果

                                                                                   表1. HeLa S3细胞同步化各周期比例  

                                                                           图2. HeLa S3细胞同步化各周期比例

结论：从图1实验结果可以看到Thymidine可以有效的将HeLa S3细胞同步化在G1/S期（release 0hr），释放量2h后细胞进入S期，释放6h后，细胞进入G2/M期，释放12h以后细胞重新进入G1期。表1和图2的统计分析可以发现，同步化后大于92%HeLa S3细胞处于S期，在释放12h以后同步进入G1期的细胞依然可以达到82%以上。

五、 参考文献
1. Loewe H, Urbanietz J. Arnzeimforsch, 24:1927, 1974.
2. Latt SA. Microfluorometric detection of deoxyribonucleic acid replication in human metaphase chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 70:3395, 1973.
3. Latt SA, Stetten G. Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimidazole dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis. J. Histochem. Cytochem., 24:24, 1976.
4. Bigler RD. A comparison of low-power helium-cadmium and argon ultraviolet lasers in commercial flow cytometers. Cytometry, 8:441, 1987.
5. Shapiro HM. Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with Hoechst 33342 and pyronin Y. Cytometry, 2:143, 1981.

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