DNA甲基化检测

    DNA甲基化是zei早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧***，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧***转变为5’-甲基胞嘧***。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。

DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用。

1. MassARRAY飞行时间质谱平台甲基化检测原理：

MassARRAY 分子量阵列基因分析系统EpiTYPER DNA甲基化分析技术结合了碱基特异性酶切反应和MALDI-TOF测序原理。两者的完美结合使得该技术成为高准确性、高通量及高灵敏度的DNA甲基化定量分析手段。

MassARRAY分子量阵列基因分析系统EpiTYPER DNA甲基化分析技术是高通量DNA甲基化定量技术。实现多重CpG的甲基化位点的定位定量检测。配套的EpiTYPER软件为用户提供便捷的数据分析和报告工具。

1.1 飞行时间质谱原理：

质谱仪简单来说就是把不同的分子按照分子量进行排序的仪器。

我们的质谱是Maldi-Tof质谱，全称是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱。将制备的样品分析物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管 , 而后用瞬时纳秒 (10-9s) 强激光激发，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子，产生的离子多为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能，进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离，在真空小管中飞行到达检测器。MALDI产生的离子常用飞行时间（Time-of-Flight,TOF）检测器来检测，不同分子量的分子飞行时间也不同，分子量越大飞行时间越长，根据飞行时间进而判断分子量大小。通过对物质的分子量进行检测，达到区分、鉴别物质的目的。

1.2 利用飞行时间质谱检测甲基化原理：

实验从亚硫酸盐处理待测DNA开始。经过亚硫酸盐处理DNA中的未甲基化的胞嘧***（C）转变为尿嘧***（U），由此在DNA模板中产生了甲基化特异的序列变化。利用5末端带有T7-启动子的引物进行PCR扩增。产物经虾碱性***酸酶（SAP）处理后用于碱基特异性的酶切反应。酶切后DNA片段的大小和分子量取决于亚硫酸盐处理后的碱基变化。配套软件EpiTYPER则能提供数字和图像注释工具，能将实验数据与客户提供的DNA序列相吻合。作为内在的质量控制机制，该系统还包括了基本统计学分析方法及数据可靠程度的评估手段，自动报告每个相应片段的甲基化程度。

2.Affymetrix芯片平台DNA甲基化检测原理：

美国 Affymetrix 公司是基因芯片产业先行者，早在1989年就研制出了世界首张基因芯片。其开发的寡核苷酸原位光刻合成专利技术(light-controlled in situ synthesis of DNA microarrays)，是目前zei高密度的芯片制备技术。Affymetrix 公司以其完备的芯片设计，稳定可靠的分析结果和强大的生物信息学分析能力，帮助研究人员在短时间内获得大量可靠的结果，为后续研究提供重要的线索和帮助。Affymetrix GeneChip生物芯片检测系统，是由高密度GeneChip芯片和试剂，杂交、扫描仪器，数据处理和分析工具组成的一整套检测平台，是世界上第一种经欧盟和美国FDA审批的可用作体外诊断的芯片系统。

目前用Affymetrix芯片发表的科学文章现已多达3万多篇文章，其中多篇文章发表在nature、science、 cell等世界zei高级别的学术刊物上。

Affymetrix公司开发的寡聚核苷酸原位光刻专利技术，利用此技术用很少的步骤可合成大量的DNA阵列。 Affymetrix的原位合成技术可制作的点阵密度高达106~1010/cm2。首先使固相片基羟基化，并用光敏保护基团将其保护起来，然后选取适当的避光膜（mask）使需要聚合的部位透光，其他部位不透光。这样，当光通过避光膜照射到支持物上时，受光部位的羟基就会发生脱保护而活化，从而可以反应结合碱基。由于参与合成的碱基单体一端可以进行固相合成，另一端受光敏基团的保护，所以原位合成后，可进行下一轮的光照、脱保护和固相合成。循环下去，不断改变避光膜的透光位点，就可以实现在同一玻片上合成成千上万种预定序列的寡核苷酸探针，现在市场上有很多甲基化的芯片可供选择，还可以随意定制甲基化芯片。

3. 其他DNA甲基化检测技术对比：

3.1 高效液相色谱 (HPLC)：

HPLC是一种比较传统的方法，是根据DNA或蛋白分子量和构象的不同而使其加以分离。由于在动态相和静态相下分子的光吸收度并不相同而加以定量。随着系统的压强的增加，其分辨率增高。故而能够定量测定基因组整体水平DNA甲基化水平。过程是将DNA样品先经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，用紫外光测定吸收峰值及其量，计算单位面积就得到基因组整体的甲基化水平。这是一种检测DNA甲基化水平的标准方法。

仪器：高效液相色谱仪；

优势：操作简单；

劣势：只能测算到基因组的甲基化程度、不准确、不能对甲基化位点定位。

3.2 甲基化敏感性限制性内切酶PCR法(MSRE-PCR)：

这种方法利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区的不切割的特性，将DNA消化为不同大小的片段后，进行PCR扩增和产物分离，明确甲基化状态再进行分析，常使用的甲基化敏感的限制性内切酶。

仪器：PCR仪、凝胶成像系统；

优势：操作简单、成本较低；

劣势：酶要求高、不准确、不能对甲基化位点定位、重现性差、通量低。

3.3 重亚硫酸盐测序法 (Bisulphite Sequencing)：

该方法首先用重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧***脱氨基转变成尿嘧***，而甲基化的胞嘧***保持不变，进行PCR扩增所需片段，则尿嘧***全部转化成胸腺嘧***，zei后，对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。

仪器：PCR仪、测序仪；

优势：准确度高、能给甲基化位点精确定位、可重复性高；

劣势：需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵，通量低。

3.4 甲基化特异性的PCR (MS-PCR)：

该方法中DNA先用重亚硫酸盐处理，随后行引物特异性的PCR。其设计两对引物，分别与重亚硫酸盐处理后的序列互补配对，即一对结合处理后的甲基化DNA链，另一对结合处理后的非甲基化DNA链。检测MS-PCR扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能扩增出片段，则说明该被检测的位点存在甲基化；反之亦然。

仪器：PCR仪、凝胶成像系统；

优势：操作简单、成本较低；

劣势：不准确、甲基化位点不能定位、通量低。

3.5 TaqMan探针法：

结合重亚硫酸盐处理待测DNA片段，设计一个能与待测位点区互补的探针，探针的5’端连接报告荧光，3’端连接淬灭荧光，随后行实时定量PCR。如果探针能够与DNA杂交，则在PCR用引物延伸时，TaqDNA聚合酶5'到3'端的外切酶活性会将探针序列上5'端的报告荧光切下，淬灭荧光不再能对报告荧光进行抑制，这样报告荧光发光，测定每个循环报告荧光的强度即可得到该位点的甲基化情况及水平。

仪器：实时荧光PCR仪；

优势：准确度高、可重复性高、高效、需样量少；

劣势：TAqman探针成本高，分析结果本底较高，通量低。

4. 应用范围：

4.1 研究遗传性疾病与甲基化相关基因异常的关系

某些遗传性疾病的发生与相关基因甲基化异常及甲基化程度有关；

4.2 疾病机制研究

        通过甲基化位点及程度了解掌握疾病发生、调控机制研究；

4.3 甲基化在癌症发生中的作用

在肿瘤细胞中，异常甲基化zei大的特点是全基因组的低甲基化和局部性(CpG岛)高甲基化并存 ，这既是癌症发生的重要原因之一，也是癌症良恶转化的重要标志。一般认为，癌症发生的机制主要包括癌基因的活化和抑癌基因的失活，目前发现二者都与基因甲基化异常有关。已发现大量的肿瘤细胞中抑癌基因的失活与该基因启动子区域的CpG岛高甲基化有直接关联；

4.4 甲基化在癌症发展中的作用

在癌症的发展中，甲基化的状态并非一成不变。癌细胞内的全基因组的低甲基化程度与疾病进展、肿瘤大小和恶性程度都有密切的关系 ，肿瘤细胞DNA的总体甲基化的程度越低，癌症的恶性程度也就越大。而CpG岛的局部高甲基化的趋势也随肿瘤的进展而向周围扩展 。由于不同癌细胞甲基化进展的程度不同，这成为癌组织异质性的重要原因之一 ；

4.5 甲基化的诊断对病情预测的和治疗

由于CpG岛的局部高甲基化的出现往往早于细胞的恶性增生，因而可用于肿瘤发生的早期预测。全基因组的低甲基化也伴随癌症的发生而出现，且随着恶性程度的增加而更加明显 ，所以它也是诊断病情的重要指标之一。甲基化技术还是肿瘤类型鉴别诊断的辅助手段，可用于癌症发生中的特异性失活抑癌基因的检测 。除可进行诊断外，甲基化的状态还可预测患者治疗的预后情况。如在肝细胞肝癌中，甲基化的总数目可作为一个独立的诊断指标，用于预测患者的生存率 ；肿瘤中，伴随诱导凋亡的基因基本上都发生甲基化；

4.6 药物开发

在近年发展中，去甲基化药物在治疗癌症中的前景更加令人注目。通过重新激活被甲基化失活的抑癌基因，可阻止癌症进一步的发生发展，甚至逆转或杀死肿瘤细胞。但目前去甲基化的药物较少，因此对甲基化药物的临床研究有广阔的前景。

4.7 发育生物学、干细胞分化的研究

        甲基化位点及程度影响了干细胞分化的方向，同时也对细胞凋亡起了很重要的作用，对甲基化的研究可以作为一个很好的基础研究工具。

DNA甲基化检测服务价格

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