人细胞色素C（CytC）酶联免疫分析（ELISA）
试剂盒使用说明书
本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中细胞色素C（CytC）的含量。
实验原理：
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人细胞色素C（CytC）的水平。用纯化的人细胞色素C（CytC）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入细胞色素C（CytC）再与HRP标记的细胞色素C（CytC）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zei终的黄色。颜色的深浅和样品中的细胞色素C（CytC）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人细胞色素C（CytC）浓度。
试剂盒组成：
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试剂盒组成 |
48孔配置 |
96孔配置 |
保存 |
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说明书 |
1份 |
1份 |
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封板膜 |
2片（48） |
2片（96） |
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密封袋 |
1个 |
1个 |
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酶标包被板 |
1×48 |
1×96 |
2-8℃保存 |
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标准品：225nmol/L |
0.5ml×1瓶 |
0.5ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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标准品稀释液 |
1.5ml×1瓶 |
1.5ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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酶标试剂 |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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样品稀释液 |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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显色剂A液 |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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显色剂B液 |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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终止液 |
3ml×1瓶 |
6ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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浓缩洗涤液 |
（20ml×20倍）×1瓶 |
（20ml×30倍）×1瓶 |
2-8℃保存 |
样本处理及要求：
1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.
7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤：
1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50<, /FONT>μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为150nmol/L，100nmol/L，50nmol/L，25nmol/L，12.5nmol/L）。
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品zei终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4. 配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7. 温育：操作同3。
8. 洗涤：操作同5。
9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
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