简单来说蛋白质从头测序就是不依赖于任何现有的DNA或者蛋白质的数据库信息，直接对蛋白质氨基酸序列进行测定。蛋白质从头测序的原理是基于蛋白酶切后的肽段分子在质谱检测中有规律性的断裂，找到特定断裂模式，再根据质谱峰之间质量差即可算出对应的氨基酸信息，以及氨基酸上的翻译后修饰。

       蛋白质从头测序法最大的特点就是可以不借助任何蛋白质或者DNA数据库信息，直接对蛋白质的序列进行分析。相比传统的质谱数据库搜索法有着不可比拟的优势，那就是从头测序法可以应用于分析新物种的蛋白质序列，以及基因组未被测序的物种的蛋白质序列。

1. 使用蛋白酶对分离纯化后的待测蛋白质样品进行酶切，将蛋白质剪切成一定大小的多肽片段。（可以分别选用多种蛋白酶进行酶切，以确保蛋白质的全序列可以被鉴定分析到；

2. 使用高效液相色谱对肽段酶切产物进行分离纯化，这样有利于接下来更为高效准确的质谱分析。；

3. 被分离的肽段再经由质谱分析前首先经过软电离处理使肽段带上一定量的电荷，接着飞行进入质谱仪。首先经过一级质谱对肽段离子进行筛选；4. 经过一级质谱筛选后的肽段分子，再进入碰撞室，与室内的碰撞气体（常用的碰撞气体通常有He，Ar，Xe，CH₄等惰性气体）进行碰撞诱导肽段共价键断裂，产生子离子，再经由二级质谱（MS²）分析肽段序列。

5. 借助特定软件对各个肽段的二级质谱峰进行从头序列分析，再对肽段序列拼接获得蛋白质全长序列

1、要求蛋白纯度80-90%以上较好，建议用2-3个酶（trypsin,  chymotrypsin, gluC）把蛋白样本消化为肽段，增加蛋白序列的覆盖率。
2、用先进Thermo质谱lumos ETD液质联用质谱仪进行数据采集；
3、用PEAKS AB这个软件解析，分析出蛋白的氨基酸序列。

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