对简单的蛋白混合物，我们采用LC-ESI-MS/MS技术进行蛋白质鉴定。样品类型包括：

• SDS-PAGE胶条

• IP、Co-IP得到的蛋白复合物

• Pull-down方法制备的蛋白混合物

• 其他蛋白混合物

技术原理

电喷雾电离质谱（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。

电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用，一般与液相色谱（LC）联用，可以对复杂样品进行质谱分析，根据样品在色谱中不同的保留时间对其进行分离后鉴定，提高了分析的效率和精确度。

 ESI-MS质谱工作原理技术流程技术特点

• 高通量，一次可鉴定多种蛋白质；

• 灵敏度高：可检测样品浓度较低的胶点；

• 通用性强，可分析蛋白质条带、免疫共沉淀洗脱液等多种形式的样品。；

• 液相与质谱连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。

样本要求

• SDS-PAGE胶条：银染、考染条带可见；

• 蛋白质溶液：蛋白质总量>5μg，浓度>0.1μg/μl。

技术平台
Thermo Scientific Q Exactive

案例解析
1、串联亲和纯化技术联合质谱鉴定乳腺癌细胞中LOX  相互作用蛋白

构建带 StrepII/FLAG 串联亲和标签的重组赖氨酰氧化酶（Lysyl oxidase, LOX）蛋白慢病毒表达载体并在乳腺癌 MDA-MB-231 细胞中表达，利用 StrepII/FLAG 标签纯化富集 LOX 的复合体，经LC-MS/MS 进行蛋白鉴定，鉴定到的  425 个蛋白。分析结果提示 LOX 所在的功能类共有 20 个，质谱中的蛋白大部分与 Cancer、Infectious Disease、Hematological Disease 、Immunological Disease 等疾病相关。鉴定到的蛋白可信度排前的参与 mTOR Signaling、Remodeling of Epithelial AdherensJunctions、Actin  Cytoskeleton Signaling 信号通路，提示 LOX 与肿瘤细胞的侵袭和转移有关。质谱蛋白相互之间的作用依据分子功能划分成 16 个网络，其中 LOX 直接参与了数据库中之一的功能网络。另外同质谱鉴定到的蛋白进行匹配，为筛选和研究赖氨酰氧化酶及其相互作用蛋白在乳腺癌细胞系内的功能奠定了实验基础。

2、家蚕蛾吐出液的酶活性及蛋白质种类鉴定

家蚕羽化时用口腔吐出液溶解前端茧层的丝胶及少量丝素后脱茧而出，测定吐出液中各种酶类的活性以及鉴定吐出液中的蛋白质种类，对解析家蚕羽化过程的溶茧机制具有重要意义。在家蚕羽化前解剖收集嗉囊液，在家蚕羽化时收集蛾吐出液，解剖获取蛾下颚晶体，测定3组样品中的蛋白酶酯酶纤溶酶和丝胶酶活性。采用液相色谱串联质谱（LC-MS）分析技术，在家蚕蛾吐出液中鉴定出29种蛋白质，其中包括14种酶类、4种蛋白酶抑制剂、5种30K蛋白、1种转运相关蛋白、2种免疫相关蛋白和3种其他蛋白质。研究结果显示了蚕蛾吐出液成分的复杂性，同时说明家蚕羽化时吐出液对丝胶和部分丝素的水解除了溶茧酶的作用外，可能还有其他成分的参与。

参考文献：

• MacCoss, Michael J.; Yates, John R. III. Proteomics:  analytical tools and techniques. 2001, Current Opinion in Clinical Nutrition  & Metabolic Care. 4, 369-375.

• Jinghua Jina, Gloria E. Meredithb, Leo Chena, Yong  Zhoua, Jing Xua, Feng-Shiun Shiea, Paul Lockhartc, Jing Zhanga. 2005,  Quantitative proteomic analysis of mitochondrial proteins: relevance to Lewy  body formation and Parkinson's disease. Molecular Brain Research, 134, 119–138.

• Christina Lind, Robert Gerdes, Ylva Hamnell, Ina  Schuppe-Koistinen, Helena Brockenhuus von Löwenhielm, Arne Holmgren, Ian A.  Cotgreave. 2002, Identification of S-glutathionylated cellular proteins during  oxidative stress and constitutive metabolism by affinity purification and proteomic  analysis. Archives of Biochemistry and Biophysics, 406, 229–240.

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