免疫组织化学(IHC)

定义：免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。

一般实验步骤：

1、脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯,依据的是相似相溶的原理.一般在每个试剂中放10min,天气热可以少放几分钟,相反,天气较冷的话,就要适当延长脱蜡时间,一般为12-15min.
2、抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3%H2O2浸泡10min，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3min（中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。
3、血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，使一些非特异性的位点封闭起来，然后放入37°C温箱中半小时。血清稀释10倍（900µlPBS：100µl血清封闭液）。
4、加一抗：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗，如果做对照实验，就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存过夜。
5、加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上二抗,然后置于37°C温箱中半小时。
6、加SABC:将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上SABC, 然后置于37°C温箱中半小时。SABC稀释100倍（990µlPBS：10µlSABC）。
7、加显色剂：将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上显色剂。（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀）A：DAB B：H2O2 C：磷酸缓冲液
8、复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于hematoxylin中染色，一般动物组织为半分钟，植物组织3-5min。
9、脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。
10、封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。  

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