细胞钙离子通道检测原理：Fluo-4 AM是最常用的检测细胞内钙离子浓度的荧光探针之一。分子式为C51H50F2N2O23，分子量为1096.95。Fluo-4 AM在Fluo-3 AM的基础上改进而成，其特点是加载更快并且在相同条件下荧光更加明亮。Fluo-4 AM将Fluo-3 AM结 构中的氯原子替换成了氟原子，导致它的最大激发波长会向短波长处偏离12nm左右。这个波长更接近于氩激光器的波长 488nm，所以用氩激光器激发时，Fluo-4的荧光强度会比Fluo-3强一倍。由于Fluo-4与钙离子的亲和力和Fluo-3相近，所以 使用上和Fluo-3也基本相同，可以使用激光共聚焦显微镜、荧光酶标仪等荧光检测仪器来测定细胞内钙离子浓度的变化。Fluo-4 AM是Fluo-4的乙酰甲酯衍生物，是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-4 AM的荧光非常弱，其荧光不会随钙离 子浓度升高而增强。Fluo-4 AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-4，从而被滞留在细胞内。Fluo-4可以和钙离 子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光，最大激发波长为494nm，最大发射波长为516nm。实际检测时推荐使用的激 发波长为488nm左右，发射波长为512-520nm。

　　实验操作步骤：

　　1. 取适量Fluo-4 AM母液，用PBS稀释至0.5-5μM的工作液。 注：工作液须即用即配，请勿反复冻融。

　　2. 对于待检测的培养细胞，去除培养液，用PBS或HBSS洗三遍。 注：因为培养液中的血清含有酯酶会导致Fluo-4 AM分解为Fluo-4，而酚红会导致荧光背景增强。

　　3. 加入Fluo-4 AM工作液，溶液量以能充分覆盖细胞为准。

　　4. 20ºC-37ºC孵育10-60分钟进行荧光探针装载。 注：如果是首次实验不能确定孵育温度和时间，建议先尝试37ºC孵育30分钟，观察荧光效果。如果细胞死亡较多，则适当 缩短时间或降低温度;如果荧光强度太弱，则适当延长时间。

　　5. 随后用PBS或HBSS洗涤3次，洗涤后可以考虑适当再孵育20-30分钟以确保Fluo-4 AM在细胞内完全转变成Fluo-4。

　　6. 如有需要，可以使用适当药物来刺激细胞。

　　7. 用激光共聚焦显微镜、荧光酶标仪、荧光分光光度计或流式细胞仪等荧光检测仪器检测Fluo-4的荧光，以确定细胞内钙离子浓度的变化。