BSP简述
BSP（Bisulfite Sequencing PCR）: Frommer等提出的研究DNA甲基化方法，此方法可靠性及精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态。结合高通量测序，可以发现更精确的甲基化修饰信息。
BSP实验流程
1. 基因组DNA提取和定量
2. NaHSO3 处理（包括纯化和脱碘基反应）使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。
3. 处理后的DNA纯化回收
4. 根据目的基因启动子序列设计相应引物，使用优化过的BSP引物进行PCR扩增
5. PCR产物高通量测序
6. 数据分析，发掘每个CpG位点的甲基化信息
BSP的技术优势
HT-BSP案例展示
目的：检测基因BDNF的甲基化水平！
第一步：样本DNA提取及质控
共有6个血液样品，样本名称参照管上的原始编号（3: 3混样）。
B190-1(病例)、B190-2（对照）以下分别简称“样品1”、“样品2”， 测试基因共10个片段（具体检测片段数量以最终引物设计后为准！）第二步：查询基因BDNF的CpG岛
在UCSC中查询，结果发现4个CpG岛，多位于BDNF基因上游及内部，有检测意义。
1、CpG: 80，基因组位置chr11:27700115-27701092，978bp。 分3段检测
2、CpG:54， 基因组位置chr11:27719098-27719618 ，521bp。分2段检测
3、CpG:14， 基因组位置chr11:27720513-27720726 , 214bp。 分1段检测
4、CpG:81， 基因组位置chr11:27721926-27723017，1092bp。 分4段检测
第三步：引物设计（以CpG：54为例）
>hg38_cpgIslandExt_CpG: 54 range=chr11:27718898-27719818 5‘pad=200 3’pad=200 strand=+ repeatMasking=none（加粗斜体下划线部分为引物位置）第四步：NaHSO3 处理及PCR扩增
1.严格按照试剂盒说明书操作，取基因组DNA 1ug进行NaHSO3 转化并纯化回收。
2.PCR扩增
3.切胶回收
第五步：Illumina 建库和测序
1. PCR产物检测合格后，再经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化等步骤完 成整个文库制备工作。文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1.5ng/ul，随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度 ＞2nM），以保证文库质量。文库构建原理图如下：
2. 上机测序
库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina HiSeq测序。
第六步：下机数据分析
1. 下机原始数据，经过去除低质量数据之后，采用perl 脚本结合PCR引物5’段barcode 序列将文库信息分离到对应样品。分离样品统计如下：
2. 甲基化水平分析
通过计算甲基化状态序列/(甲基化状态序列+非甲基化状态序列)得到甲基化比例，并计算出两组的差异甲基化水平（Diff_meth=实验组甲基化比例-对照组甲基化比例），当差值>0.1（即百分之十）时，认为该CG位点存在甲基化差异。为了全面直观的展示样品之间的目的基因甲基化水平，做无监督聚类分析，以热图形式显示。
3. 目的基因待测片段中 CG位点的甲基化点状图
点状图是展示甲基化的经典方法，白色空心点表示未发生甲基化的CG位点，黑色实心点表示发生甲基化的CG位点。4. 目的基因待测片段的综合甲基化水平柱状图
分别综合统计整个序列在实验组和对照组中的甲基化比例（黑色实心点数/黑色实心点数+白色空心点数），将实验组与对照组的甲基化比例为数据源，制作柱状图。BSP甲基化检测的样品要求
浓度>100ng/ul（浓度最低不能低于40ng/ul）；体积20-30ul，每个样品总量不少于2μg；-80度保存，干冰运输。
备注：样品是否满足建库测序要求以PCR结果为准，未达到此标准的样品可以尝试进行NaHSO3 处理→PCR实验，PCR不成功收取实验成本费。 
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