免疫共沉淀(Co-IP)技术

一、原理

      免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到富集的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

该技术优点如下：

      1.相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；

      2.蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；

      3.可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

然而该技术也存在缺点，具体如下：

      1.可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；

      2.两蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；

      3.须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

二、准备工作

试剂：冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机。

RIPA Buffer配制：

      基础成分：Tris-HCl（缓冲液成分，防止蛋白变性）；NaCl（盐份，防止非特异蛋白聚集）；NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液）；去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存）；

注意：检测激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。

RIPA蛋白酶抑制剂：

      苯甲基磺酰氟（PMSF）：用异丙醇配制成200mM的储存液，室温保存。

EDTA：

      钙螯合剂，用H2O配制成100mM的储存液，PH 7.4。

亮抑酶肽（Leupeptin）：

      用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存。

抑蛋白酶肽（Aprotinin）：

      用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存。

胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）：

      用甲醇配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存。

RIPA磷酸（酯）酶抑制剂

      激活的Na3VO4：用H2O配制成200mM的储存液。

NaF：

      200mM的储存液，室温保存。

注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂。

工作液配制：

配制100ml的modified RIPA buffer：

      1.称取790mg的Tris-Base，加到75ml去离子水中，加入900mg的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.4；

      2.加10 ml 10%的NP-40；

      3.加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清；

      4.加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存；

      5.理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 μl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 μl），但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。

各种成分在工作液中的终浓度：

      * Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4

      * NP-40: 1%

      *去氧胆酸钠：0.25%

      * NaCl: 150 mM

      * EDTA: 1 mM

      * PMSF: 1 mM

      *抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂:各1 μg/ml

      * Na3VO4: 1 mM

      * NaF: 1 mM

三、实验流程

方案1：

      1. 转染后24-48h可收获细胞，加入适量RIPA细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min，细胞裂解液于4°C，最大转速离心30 min后取上清；

      2. 取少量裂解液以备Western blot分析（Input），剩余裂解液加1μg相应的抗体到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；对照组直接加入跟所用抗体同种型对照；

      3. 取10μl protein A琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3,000 rpm离心3 min；

      4. 将预处理过的10μl protein A琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；

      5. 免疫沉淀反应后，在4°C以3,000 rpm速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；小心吸去上清，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS上样缓冲液，沸水煮5分钟；

      6. SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。通过免疫共沉淀确定结合蛋白。

方案2：

      1. 转染后24-48 h，用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；

      2. 加入适量预冷的RIPA Buffer；

      3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5lml EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）；

      4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中；

      5. 准备Protein A agarose，用PBS洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠；

      6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景；

      7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子；

      8. (Bradford法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）；

      9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果目的蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）；

      10. 加入一定体积的目的蛋白抗体到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因目的蛋白在不同细胞系中的多少而异；

      11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育；

      12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）；

      13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS；

      14. 用60μl  2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）；

      15. 将上样样品煮5min，以游离抗原、抗体和珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性；

四、注意的问题

      1. 细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer；

      2. 使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用；

      3. 使用对照抗体：

            单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗。

            兔多克隆抗体：正常兔IgG。

在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性，应注意以下几点：

      1. 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；

      2. 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；

      3. 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。

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