基于CRISPR/cas9的基因功能缺失文库筛选

CRISPR/cas9基本原理

Int. J. Mol. Sci. 2015, 16(11), 26077-26086.

      Cas9是一种核酸酶，在sgRNA引导下Cas9定点切断DNA，造成双链断裂，双链断裂的部位通过非同源末端接合（NHEJ）修复，往往会造成几个碱基的插入或删除，形成移码突变。而双链断裂的部位通过同源重组则可以定向插入感兴趣的基因。

基于CRISPR/cas9的基因功能缺失文库筛选(in vitro)

      Step1：寻找靶点，设计sgRNA文库(GeCKO文库)；

      Step2：合成oligo，构建载体，病毒包装文库；

      Step3：文库病毒感染目的细胞，筛选，深度测序。

      [注]GeCKO:genome-scale CRISPR-Cas9 knockout

有助于细胞耐药的sgRNA将在14天的细胞中富集

      1.Cas9-EGFP慢病毒感染NSCLC细胞，并筛选表达cas9-EGFP的阳性细胞；

      2.sgRNA文库病毒感染Cas9-EGFP阳性细胞；

      3.筛选成功感染的细胞；

      4.将细胞移植裸鼠成瘤；

      5.深度测序，分析晚期肿瘤和转移灶中sgRNA富集情况。

技术流程

基因功能缺失文库的应用

耐药机制研究

      张峰实验室2013年在SCIENCE发表的文章Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells中报道，他们利用CRISPR-Cas9文库对人类黑色素瘤A375细胞中的18,080个基因进行筛选，最终发现基因NF2、CUL3、TADA2B、TADA1参与了黑色素瘤A375细胞抵抗维罗非尼(vemurafenib)的耐药过程。

肿瘤发生发展机制研究

      张峰实验室2015年在CELL杂志上报道，他们利用CRISPR-Cas9技术对肿瘤的生长和转移进行全基因组功能缺失筛选。利用带有67,405个sgRNA的基因组规模文库，构建突变细胞系并移植裸鼠，分析晚期肿瘤和转移灶细胞的基因表达情况，发现NF2、PTEN、CDKN2A、TRIM72、FGA、miR-345及miR-152基因能够促进非小细胞肺癌细胞侵袭，且这些基因与原发性肿瘤的生长和侵袭成正相关。

基因调控机制研究

      CRISPR-Cas9文库筛选技术不仅可以用于编辑人类细胞蛋白编码基因，对于基因组中的调控元件也同样有效，利用这种方法可以对基因环路上游调控机制进行分析。Nature biotechnology发表文章，科研人员利用CRISPR-Cas9文库对癌症细胞中关键的转录因子p53和ERα的增强子元件的685个基因位点进行筛查。通过CRISPR-Cas9文库筛选，共鉴定出3个增强元件与ERα的相关;3个增强元件与p53功能相关联，其中2个增强元件与p53完全结合才能激活细胞衰老过程。

      Korkmaz, G., et al., Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol, 2016. 34(2): p. 192-8.

非编码RNA作用机制研究

      CRISPR-Cas9文库的建立可以实现基因组的大规模筛选，为了对非编码基因的功能进行验证，Naturebiotechnology发表文章，提出构建了psgRNAs文库的方法，这种成对的sgRNA可在同一基因中造成两处断裂，形成大片段缺失，从而影响表型变化，成为研究非编码基因的重要方法。使用慢病毒psgRNA文库，对人源肝癌细胞系Huh7.50C进行基因组的700个IncRNA和另外5种癌症细胞进行敲除实验，最终筛选到51个IncRNA基因能够促进或者抑制肿瘤的生长。

      Zhu, S., et al., Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nat Biotechnol, 2016.34(12): 1279-1286.

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