病毒研究和疫苗开发

一、病毒蚀斑(Plaques)和病毒灶(Foci)-明场计数

二、病毒灶斑(Foci)-荧光计数

——Dylight488荧光病毒灶(Foci)计数

     Vero宿主细胞铺入96孔板中，孵育过夜，加入5倍梯度稀释的流感病毒颗粒。再培养24hrs后，用偶联Dylight488的病毒蛋白一抗标记感染病毒灶，计算感染细胞数。

图1.Dylight488标记的被流感病毒感染的阳性细胞计数

——GFP表达荧光病毒灶Foci计数

     Vero宿主细胞接种在96孔板中孵育过夜，加入2倍梯度稀释的表达GFP的流感病毒颗粒，孵育24h后计数感染细胞数。

图2.荧光成像。上图为每孔荧光病毒蚀斑情况，不同病毒梯度组之间病毒感染差异一目了然。

三、病毒滴度检测

     通过荧光标记被感染细胞的方法，直接细胞计数测量病毒的滴度。

——用mKate2荧光蛋白指标在96孔板中检测流感病毒滴度

图3.表达mKate2的感染细胞明场和荧光图像。96孔板中铺入MDCK宿主细胞，贴壁过夜。mKate2标记的流感病毒进行5倍梯度稀释，并加入到宿主细胞里。孵育24hrs后计数分析。

——在96孔板中利用GFP荧光蛋白标签检测Zika病毒滴度

     通过白光通道识别Raji细胞，在此基础上利用绿色通道对GFP荧光标记细胞直接检测。Vero细胞既可以用白光通道，也可以用Hoechst荧光通道为依据，进行GFP荧光的判定。

图4.细胞成像。在96孔板中铺入Vero和Raji宿主细胞，贴壁生长过夜，以2倍梯度稀释加入病毒颗粒（RVP-GFP），孵育24hrs，对感染细胞成像。

四、抗体中和试验

     中和试验是用来检测和定量抗体中和能力的实验。中和试验还可以用来测定化合物药物的抗病毒效果。可分为3种，蚀斑减少中和试验(Plaque reduction neutralization test,PRNT)、灶斑减少中和实验（Focus reduction neutralization test,FRNT），以及微量中和试验（Microneutralization）。微量中和试验（Microneutralization）属于小体积，微孔板（96-384）中进行的中和试验，适合筛选。

图5.不同疫苗的中和试验结果

优势：

1）直接在96孔板中进行高通量自动成像和分析；

2）无需胰酶消化，直接对受感染细胞进行计数，8min内完成抗体中和测定；

3）结合自动化叠扳机，可一次性批量分析50块板子。

4）多通道扫描分析一块96孔板不超过15分钟；

五、病毒感染及监测

1. 监测病毒感染的过程。

2. 检测细胞固定及抗病毒蛋白免疫染色后的病毒感染性。

六、病毒转导效率检测

1.直接检测病毒转导效率；

2.可计算瞬时和稳定转导效率；

3.可用于AVV病毒载体的病毒滴度优化。

4.轻松快速检测慢病毒转导效率；

图6.慢病毒梯度转导HEK293T细胞（明场+GFP荧光）。第一排：明场视野下的细胞图像；第二排：不同病毒梯度下GFP阳性的细胞图像；第三排：红色轮廓圈定的GFP阳性细胞。接种并培养HEK293T细胞至细胞覆盖率80%。加入10倍梯度稀释的慢病毒孵育后，进行每孔明场视野和GFP通道图像扫描，并分析转导效率。

七、细胞病变效应（CPE）

     快速评估病毒感染。提供高质量的明场全孔图片，对基于宿主细胞层特征性改变进行CPE效应的量化。支持感染相关的，基于荧光检测的功能性实验。

图7.病毒感染评估。针对牛病毒性腹泻病（BVD）和牛鼻甲状腺细胞感染（BT2），将病毒梯度稀释接种于孔板中，设置阈值功能可以直观显示出红色孔（受感染）和绿色孔（不受感染）。

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