技术服务详细描述 伯豪生物官网 www.shbio.com 最新官网消息 单细胞 RNA 测序科研服务来了 技术平台 1、SMART-seq2012 年，由美国和瑞典的科学家共同开发了称为 Smart-Seq（Switching mechan
伯豪生物官网 www.shbio.com 最新官网消息 单细胞 RNA 测序科研服务来了
技术平台
1、SMART-seq
2012 年，由美国和瑞典的科学家共同开发了称为 Smart-Seq（Switching mechanism at 5’end of the RNA transcript）的技术 [1]。在 2013 年，Nature Methods 杂志上报告了新的方案，被称为 Smart-Seq2[2]，随后在 2014 年他们有公布了详细的操作流程 [3]。获取单细胞并裂解细胞后，含有 oligo-dT 的引物与 mRNA 的 poly- A 结合，逆转录酶 MMLV 进行逆转录，逆转录酶到达 mRNA 5’末端时，MMLV 的末端转移酶活性会在一链 cDNA 的 3'末端增加额外的胞嘧***，这时 TSO 引物 3' 末端的 rGrG+ G 结合到第一链末端的胞嘧***，然后以第一链 cDNA 为模版进行延伸合成互补的第二链，全长 cDNA 经过 PCR 扩增后进一步进行测序文库的构建。
SMART-seq2 技术原理
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技术优势
▲ 起始量低
1 个细胞起始，适用于难以满足 10X Genomics 等平台起始细胞量要求的样本。
▲ 覆盖度高
测序覆盖 cDNA 的全长序列，每个细胞能够获得上万个基因的表达。
▲信息全面
除了获得基因表达信息，数据能够用于可变剪接，cSNP 等分析，以及带 poly- A 结构的 lncRNA 研究。
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文库结构
图 SMART-seq2 文库示意图
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建议测序深度及参数
指标 | 参数 |
测序深度 | 6Gb/cell |
测序类型 | PE150 |
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样本要求
▲类型： 新鲜组织，原代细胞，细胞系等。
▲来源： 血液提取、磁珠富集、流式富集、组织解离等。
▲样本量： 单个细胞（或微量细胞）。
▲保存运输： 细胞放入 SMART-seq 试剂盒指定的裂解液中，-80°C 保存，干冰运输。
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2、10X Genomics
10X Genomics 公司的 Chromium 系统利用 8 通道的微流体“双十字”交叉系统，将含 barcode 的凝胶珠（Gel Beads）、细胞和酶的混合物、油三者混合，形成 GEMs（油包水的微体系）。GEMs 形成后，细胞裂解，凝胶珠自动溶解释放大量 barcode 序列，随后 mRNA 逆转录产生带有 10X barcode 和 UMI 信息的 cDNA，构建标准测序文库，其中 10X barcode 用于区分细胞，UMI 用于区分 mRNA 分子。
图 10X genomics 技术原理
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技术优势
▲通量高
一张芯片具有 8 个独立的通道，可供 8 个样本同时上机，每个通道最高可捕获 10000 个细胞。
▲捕获率高
单细胞捕获效率高达 65%，多细胞比例 <0.9%（1,000 个细胞中）。
▲ 延展性强
除了获得单细胞 mRNA 的信息，还提供了单细胞 TCR/BCR、单细胞表面蛋白、单细胞 ATAC 等多种解决方案。
文库结构
图 10X Genomics 3’gene expression 文库示意图
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建议测序深度及参数
指标 | 参数 |
测序深度 | 50,000~100,000 reads/cell |
测序类型 | PE150 |
样本要求
▲类型： 新鲜组织，原代细胞，细胞系等。
▲来源： 血液提取、磁珠富集、流式富集、组织解离等。
▲ 样本量及其它质控要求：
| 样本类型 | 样本质控要求 |
| 细胞悬液 | >105 目标细胞个数（最少 10,000 个细胞）； |
| 活率 >80%； | |
| 浓度 500-1,000 个细胞 /ul； | |
| 细胞间无粘连（成团率 <5%）； | |
| 无大于 40μm 的细胞碎片或其他颗粒物； | |
| 不存在逆转录抑制剂和非细胞的核酸分子。 | |
| 血液 | EDTA 抗凝的全血（不可肝素抗凝），>5ml。 |
| 组织 | 0.3cm×0.3cm（不超过 0.5cm×0.5cm）的新鲜组织，4～5 块。 |
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▲保存运输：
（1）细胞悬液：最好现场制备，如要运输，建议使用伯豪生物自主研发的单细胞保护液，4°C 运输，48 小时内送达伯豪生物实验室。
（2）血液：EDTA 抗凝的全血，4°C 运输，2 小时内送达伯豪生物实验室；或提取 PBMC 后冻存，干冰运输。
（3）组织：建议使用伯豪生物自主研发的单细胞组织保护液，4°C 运输，48 小时内送达伯豪生物实验室。
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3、BD Rhapsody
BD Rhapsody 技术利用卡式芯片在磁性的寡核苷酸条形码标记微球上实现单细胞捕获和 mRNA 转录本的分子标签，然后将这些微球合并到单个管中用于 cDNA 扩增和文库构建。可满足 100~10000 个细胞的自动分选、扩增及建库。
图 BD Rhapsody 技术原理
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此外，该技术使用带有寡核苷酸的高质量抗体（Ab-oligos），这条寡核苷酸带有抗体特异的条形码，细胞在经过 Ab-oligos 标记后，可在单细胞水平同时获得转录组和蛋白表达。
图 单细胞 mRNA 与蛋白同时测序
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技术优势
| 高效 | 每个样本可测 100~10000 个细胞； |
| 2 天内完成细胞悬液制备、单细胞捕获、扩增以及建库。 | |
| 灵活 | 抗体标签技术可实现多样本混合捕获； |
| 可选择全转录组测序或目标基因测序。 | |
| 可靠 | 利用成像系统对单细胞捕获过程进行质控； |
| 单细胞捕获效率高达 80%，多细胞比例 <1%（1,000 个细胞中）。 | |
| 整合 | 可同时检测单个细胞的 mRNA 水平与蛋白水平。 |
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文库结构
图 BD Rhapsody 基因表达文库示意图
建议测序深度及参数
指标 | 参数 |
测序深度 | 50,000~100,000 reads/cell |
测序类型 | PE150 |
样本要求
▲类型： 新鲜组织，原代细胞，细胞系等。
▲来源： 血液提取、磁珠富集、流式富集、组织解离等。
▲样本量及其它质控要求：
| 样本类型 | 样本质控要求 |
| 细胞悬液 | > 10* 目标细胞个数（最少 10,000 个细胞）； |
| 活率 >80%； | |
| 浓度 500-1,000 个细胞 /ul； | |
| 细胞间无粘连（成团率 <5%）； | |
| 无大于 40um 的细胞碎片或其他颗粒物； | |
| 不存在逆转录抑制剂和非细胞的核酸分子。 | |
| 血液 | EDTA 抗凝的全血（不可肝素抗凝），>5ml。 |
| 组织 | 0.3cm×0.3cm（不超过 0.5cm×0.5cm）的新鲜组织，4~5 块。 |
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▲ 保存运输：
（1）细胞悬液：最好现场制备，如要运输，建议使用伯豪生物自主研发的单细胞保护液，4°C 运输，48 小时内送达伯豪生物实验室。
（2）血液：EDTA 抗凝的全血，4°C 运输，2 小时内送达伯豪生物实验室；或提取 PBMC 后冻存，干冰运输。
（3）组织：建议使用伯豪生物自主研发的单细胞组织保护液，4°C 运输，48 小时内送达伯豪生物实验室。
数据分析
图 数据质控及过滤
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图 去除批次效应
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图 单细胞 RNA 测序细胞亚群注释
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图 单细胞 RNA 测序样本间的细胞构成差异
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图 单细胞 RNA 测序 Marker 基因分析
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图 单细胞 RNA 测序拟时序分析
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图 单细胞 RNA 测序拟时序 GO 注释
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图 单细胞 RNA 测序拟时序分化转录因子调控网络
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图 单细胞 RNA 测序细胞亚群的功能富集分析
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图 单细胞 RNA 测序细胞亚群的功能富集在样本间的差异
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图 单细胞 RNA 测序样本间的功能差异分析
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图 细胞通讯网络
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应用方向
1、胚胎发育
人类胚胎发育早期仅能收集微量的胚胎细胞和干细胞，这对于了解控制胚胎发育的基因调控网络是一个难题，利用单细胞 RNA-Seq 技术对转录组进行分析则克服了转录组分析对细胞数量要求的限制，近年来已有多篇相关报道。北京大学汤富酬教授课题组早在 2009 年就对单个小鼠卵裂球的进行 RNA-Seq[4]，检测到了比微阵列技术多 75%（5270）的表达基因，并且确定了 1753 个新的可变剪接位点。这种单细胞 mRNA- Seq 检测将大大提高我们对单个细胞在哺乳动物发展中转录复杂性的分析能力，尤其是胚胎发育早期和干细胞这类在体内罕见的细胞群。2013 年，他们又对 90 个处于不同发育阶段的人类早期胚胎细胞以及 34 个胚胎干细胞进行了详尽的分析 [5]，检测出了 22,687 个母源表达基因，其中包括 8,701 条长链非编码 RNAs，相比于以往通过 microarray 检测出的 9,735 个母源基因数量大大增加。研究还发现了 2,733 条新的 lncRNAs，其中许多只在特定的发育阶段表达。此外，实验还检测到 1498 个基因在上胚层（Epiblast，EPI）和体外人类胚胎干细胞间存在差异表达，证实了 EPI 和 ESCs 具有显著不同的转录组，有显示差异性表达，从而解答了人类上胚层和体外干细胞之间的基因表达是否相同这一由来已久的问题。
图 单细胞 RNA 测序应用：早期胚胎的单细胞测序 [5]
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2、器官发育
发育是一个极其复杂的过程，器官发生涉及到多种细胞类型的协调作用，期间基因表达受到严密、精准的调控，这一过程中的基因表达调控机制仍然亟需深入研究。心脏是哺乳动物在胚胎期最先形成的功能器官之一。尽管已有对小鼠胚胎心脏发育的大量系统研究，但是人类与小鼠的心脏存在着很大差异。2019 年，汤富酬课题组和乔杰课题组合作，利用高精度单细胞转录组测序技术对人类胚胎 5 周至 25 周心脏的 4000 多个单细胞进行了系统的分析 [6]。该研究系统鉴定了人类胚胎期心脏的主要细胞类型，包括心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、瓣膜细胞、心外膜细胞、平滑肌细胞以及各种免疫细胞（包括肥大细胞、巨噬细胞、T 细胞和 B 细胞）。随着心脏发育进展，心房、心室中的心肌细胞比例显著下降，成纤维细胞、巨噬细胞等非心肌细胞的比例逐渐上升，这说明在发育过程中成纤维细胞等非心肌类型细胞对心脏发育的作用可能越来越重要。此外，还发现心肌细胞解剖位置特异性的基因表达特点，而这些特点在早至胚胎发育第 5 周时就已经有明确显现。此外，通过与已经发表的小鼠心脏发育的单细胞转录组数据进行系统比较，鉴定出一系列人类心脏发育过程中主要细胞类型特异表达的重要基因。该研究还发现人类与小鼠的心脏中心肌细胞是最为相似的细胞类型，而成纤维细胞等细胞类型的物种间差异较大，这为利用小鼠模型研究人类的心脏发育提供了参比标准。
图 单细胞 RNA 测序应用：脏发育过程中主要细胞类型的时空特征 [6]
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3、干细胞分化
造血干细胞（HSC）具有长期自我更新、分化成多种成熟血细胞的潜能。它起源于胚胎前体，包括生血内皮细胞和造血干细胞前体（pre-HSCs）。2016 年，军事医学科学院刘兵课题组利用 pre-HSCs 特异性的表面标志，分离出高纯度的 pre-HSCs。并针对 HSC 发育过程中具有代表性的 5 类细胞进行单细胞转录组测序，绘制了 HSC 发育过程的转录组图谱，揭示了 pre-HSC 在转录活性、基因表达、代谢状态、信号通路和转录因子网络等方面的特征 [7]。发现并揭示 mTOR 信号通路在特异性调控 HSC 发育中发挥了关键作用。此外，还发掘出 Pre-HSC 的 98 个特征基因。该研究为今后阐明 HSC 的体内发育规律、发掘 HSC 的体外再生策略提供了可靠的理论依据和数据资源。基于以上单细胞转录组数据，课题组在 2019 年进一步描绘出 HSC 发育全程的 lncRNA 动态表达图谱，并鉴定到在 HSC 发育过程中重要的功能性 lncRNA 分子 [8]。本研究通过生物信息学分析筛选获得一组潜在的功能性 lncRNA，并通过体外功能实验发现 6 个可能在胚胎造血发育中发挥作用的 lncRNA。利用条件基因敲除研究策略，着重阐明了 lncRNA-H19 对于 AGM 区 HSC 发生的重要作用。LncRNA-H19 的缺失使得重要造血转录因子（包括 Runx1 及 Spi1 等）的启动子区域高甲基化并下调其表达，以致血管内皮细胞向 pre-HSC 的转化阻滞。
图 单细胞 RNA 测序应用：HSC 发育过程中的基因动态图谱 [7]
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4、神经科学
神经科学是单细胞测序的另一个应用领域，哺乳动物的大脑中有数十亿个神经元，每个神经元可根据形态特征，电生理特性，分子标记进行归类。在一群细胞中，单个神经元特异性的信息就被稀释了，少数细胞特异的基因表达则有可能无法检测到。研究不同神经元的表达模式能够为我们提供更全面的基因表达图谱、甚至表达调控网络。而且，将单个神经元的基因表达于神经元的表型信息结合起来，还能帮助我们对神经元进行更加准确和细致的分类。上海伯豪助力中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所张旭院士研究组，通过高覆盖度的单细胞测序和以神经元大小为参考的层次聚类，对小鼠背根神经节初级感觉神经元进行了分类，又通过全细胞膜片钳在体记录结合单细胞 PCR 方法可检测各类初级感觉神经元对外周皮肤刺激的反应。该工作首次通过高覆盖的单细胞测序对初级感觉神经元进行了重新分类，并且建立了基因表达与在体功能的相互关系 [9]。
图 单细胞 RNA 测序应用：神经元单细胞测序及亚群分类 [9]
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5、肿瘤微环境
肿瘤细胞能够采用不同策略，使人体的免疫系统受到抑制，不能正常杀伤肿瘤细胞，上述过程被称为免疫逃逸。免疫治疗通过激活人体自身的免疫系统，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤。其中抗程序性死亡蛋白 1（programmed death 1, PD-1）及其配体（PD-L1）抑制剂是目前研究最多，发展最快的一种免疫疗法。在各种肿瘤中，接受 PD-1 /PD-L1 抑制剂单药治疗患者的客观有效率也仅为 10-30%，大部分患者对免疫检查抑制剂并不敏感。随着研究的深入，人们逐渐了解到肿瘤微环境的复杂性和多样性，以及它对免疫治疗的重要影响。肿瘤微环境与肿瘤细胞相互作用，共同介导了肿瘤的免疫耐受，从而影响了免疫治疗的效果。抗肿瘤免疫应答是由众多免疫细胞和分子参与的复杂过程，受到机体复杂而精细的调控，这其中的机制仍有待进一步研究。2017 年 6 月，北京大学张***课题组及其合作在 Cell 杂志发表了肝癌 T 细胞图谱研究 [10]，研究总共获得 5063 个单细胞的数据，总共聚类为 11 个 T 细胞亚群，包括 5 个 CD8+ T 细胞亚群和 6 个 CD4+ T 细胞亚群。其中肝癌组织中侵润 Tregs 细胞亚群（C8_CD4-CTLA4）和耗竭性 CD8 T 细胞亚群（C4_CD8-LAYN）显著富集，并且在这两类细胞中表达的 PDCD1 和 TIGIT 等，是免疫治疗的靶点。在肿瘤侵润性 Tregs 中，共鉴定出 401 个特异表达基因，在耗竭性 CD8 T 细胞中，鉴定出 82 个特异表达基因，并且发现了新的耗竭 maker，如 LAYN，PHLDA1 和 SNAP47 等。值得注意的是，其中 22 个耗竭 marker 同时也在肿瘤侵润性 Tregs 细胞中高表达，例如 CTLA4 和 LAYN 等。并且利用 TCGA 的数据进行生存分析，发现 LAYN 的表达显著降低生存期。本研究还在单细胞水平进行了 TCR 测序和分析，结果发现，在肿瘤侵润的 exhausted T 细胞和 Tregs 细胞中，观察到 TCRs 发生了重复使用。在肿瘤组织中含有相同 TCR 的 T 细胞比例较高，而在外周血和正常组织中比例较低，这说明在肿瘤中的 exhausted T 细胞和 Tregs 细胞发生了克隆扩增。并且相比于早期病人，晚期病人中 T 细胞的克隆扩增更加明显。本研究为肿瘤免疫的图谱勾画做出了范式，也为今后其他肿瘤开展类似的研究及各类肿瘤免疫的发展提供基础。
图 单细胞 RNA 测序应用：肝癌患者的单细胞测序 [10]
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6、用药指导
药物诱发的超敏综合症（DiHS/DRESS）是一种致命的多器官炎症性疾病，与疱疹病毒再激活和诱发的自身免疫性疾病相关。病理生理学仍然不清楚，临床治疗的选择有限。2020 年 1 月发表在 Nature Medicine 上研究对 DiHS/DRESS 患者的皮肤和血液进行了 scRNA-seq 检测 [11]。皮肤活检组织通过单细胞 RNAseq 发现，患者对比健康人差异表达基因数量最多的是淋巴细胞群体。分析皮肤活检的淋巴细胞，发现患者淋巴细胞呈现不同的分群。患者淋巴细胞中高表达的代表性基因有 CCR10，JAK3，STAT1 等。
图 单细胞 RNA 测序应用：患者皮肤活检的淋巴细胞呈现不同的分群 [11]
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血液 PBMCs 细胞通过单细胞测序发现，患者对比健康人差异表达基因数量最多的是 CD4 和 CD8 阳性的亚型细胞和增殖的细胞。比较血液 PBMCs 在患者和健康人中的细胞群体分布，发现 CCR4 和 CCR10（免疫细胞皮肤归巢趋化因子受体）高表达的 CD4 和 CD8 阳性细胞在患者中显著高于健康人。在患者的这个细胞群体中，表达 JAK3，STAT1，IL2RG 等基因的细胞比例明显高于健康人。
图 单细胞 RNA 测序应用：患者血液的 CD4 和 CD8 细胞呈现不同的分群 [11]
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给予患者 JAK 抑制剂（tofacitinib）和***抗疱疹病毒抑制剂（valganciclovir）后，患者的症状得到了极大的临床获益。治疗前后的血液 PBMCs 细胞再次经过单细胞 RNAseq 检测发现细胞群体分布明显分化。体外实验也证实 JAK 抑制剂（tofacitinib）和抗病毒药物（Ganciclovir 和 Artesunate）能够有效抑制药物（SMX-TMP）诱导的 T 细胞增殖。
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7、病毒感染
2020 年 1 月，整个中国因新型冠状病毒 2019-nCov 得了一场“感冒”。疫情一开始，武汉病毒研究所石正丽团队就用实验证实了血管紧张素转化酶 2（Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）是新型冠状病毒感染人体的受体基因。2020 年 1 月 26 日，上海同济大学医学院左为研究团队在《bioRxiv》上发表了题为“Single-cell RNA expression profiling of ACE2, the putative receptor of Wuhan 2019-nCov”的文章 [12]。
该研究利用已有的数据库，结合单细胞 RNA 测序技术中相关生信分析，对 ACE2 在人肺内单个细胞的表达情况进行了分析，共涉及 8 个样本，43134 个细胞。结果表明：ACE2 受体主要在一部分（1% 左右）II 型肺泡上皮细胞（AT2）中表达；同时发现这些 AT2 细胞除了表达病毒受体，还表达与病毒复制和传播相关的基因，说明其很可能是冠状病毒的靶细胞。可见，单细胞测序技术不仅是科研的利器，同时还为破解疫情做了应有的贡献。
图 单细胞 RNA 测序应用：ACE2 和其它 marker 基因在细胞亚群中的表达 [12]
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参考文献
[1] Ramskold D, Luo S, Wang YC, et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol 2012, 30(8):777-782.
[2] Picelli S, Björklund ÅK, Faridani OR, et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat Methods 2013, 10(11):1096-8.
[3] Picelli S, Faridani OR, Björklund AK, et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc 2014, 9(1):171-81.
[4] Tang F, Barbacioru C, Wang Y, et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nat Methods 2009, 6(5):377-382.
[5] Yan L, Yang M, Guo H, et al. Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantation embryos and embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol 2013, 20(9):1131-1139.
[6] Cui Y, Zheng Y, Liu X, et al. Single-Cell Transcriptome Analysis Maps the Developmental Track of the Human Heart. Cell Rep 2019, 26(7):1934-1950.e5.
[7] Zhou F, Li X, Wang W, et al. Tracing haematopoietic stem cell formation at single-cell resolution. Nature 2016, 533(7604):487-92.
[8] Zhou J, Xu J, Zhang L, et al. Combined Single-Cell Profiling of lncRNAs and Functional Screening Reveals that H19 Is Pivotal for Embryonic Hematopoietic Stem Cell Development. Cell Stem Cell 2019, 24(2):285-298.e5.
[9] Li CL, Li KC, Wu D, et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Res 2015, 26(1):83-102.
[10] Zheng C, Zheng L, Yoo JK, et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell 2017, 169(7):1342-1356.
[11] Kim D, Kobayashi T, Voisin B, Jet al. Targeted therapy guided by single-cell transcriptomic analysis in drug-induced hypersensitivity syndrome: a case report. Nat Med 2020,26(2):236-243.
[12] Yu Zhao, Zixian Zhao, Yujia Wang, et al. Single-cell RNA expression profiling of ACE2, the putative receptor of Wuhan 2019-nCov. bioRxiv 2020.
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