短链脂肪酸靶标定量（代谢组学）检测分析方案

一、项目简介

1.1 短链脂肪酸概述

短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs），也称挥发性脂肪酸（Volatile fatty acids，VFA），根据碳链中碳原子的多少，把碳原子数为1-6的有机脂肪酸称为短链脂肪酸，主要包括乙、丙、丁酸、异丁酸、异戊酸、戊酸。 

短链脂肪酸被后肠迅速吸收后，既储存了能量又降低了渗透压，并且短链脂肪酸对于维持大肠的正常功能和结肠上皮细胞的形态和功能具有重要作用。近端及远端结肠内SCFAs浓度分别约120mol/L和90mol/L，其中最重要且相对较多（占总量95%）的是乙、丙、丁酸，三者比例大致为3:1:1。受发酵底物、细菌种类等因素的影响，肠道内所产生的短链脂肪酸的种类和数量不同，其发挥的作用也不尽相同。表1. 肠道内主要细菌数量及代谢产物

1.2 技术路线

图1. 短链脂肪酸靶标定量（代谢组学）技术路线图
 

1.3分析内容

基础数据分析包括：数据预处理，差异化合物筛选，PCA模式识别。

1.4检测平台

分析检测平台：GC-FID或GC-MS

二、检测分析方案

2.1标准品配置

建立标准物质校准曲线，标准物质清单见表2：

表2. 标准物质列表

我们采用严格的质量控制体系来保证数据的可靠性：

表3. 质量控制体系

说明：

⒈精密度：指用某种方法重复测定同一均质样品所得测定值的彼此接近程度，表示分析结果的重复性。常用标准差（SD）或相对标准偏差（RSD）表示。在相同条件下，由一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性；在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度，称为中间精密度；在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的精密度，称为重现性。

⒉准确度：指测定值（平均值）与真实值的接近程度，该指标主要是通过回收率来反映。

3.回收率：在空白样本中添加一定量待测标准样品，制成已知含量的样本，然后按拟定的方法对样本进行提取、净化和测定。所得到的实测值与已知值比较，实测值与已知值的百分率即为该方法的回收率。

图1. 标准品校准曲线（以乙酸，丁酸为例）

2.2数据预处理

对原始数据进行峰解卷积，积分，峰对齐，标准化处理。通过原始总离子流(TIC)色谱图，初步观察仪器的保留时间重现性，所测得物质的情况。

图2. 代表样品GC-MS总离子流色谱图

2.3 定量结果

通过标准曲线计算样品中短链脂肪酸的定量结果，并结合学氏T检验统计组间差异表达的化合物。

表4. 短链脂肪酸定量分析结果

2.4 PCA分析

对样本进行主成分分析能从总体上反应各组样本之间的总体代谢差异和组内样本之间的变异度大小。使用SIMCA软件(V14.1, Umetrics, Umea, Sweden)，对数据进行UV格式化（Unit Variance Scaling）和平均中心化（Mean-Centered）处理，然后进行自动建模分析，以获得更加可靠且更加直观的结果。例图如下所示：

图3. PCA模式识别得分图

 图4. PCA模式识别载荷图