病理实验制片过程中，我们经常会遇到含钙高的组织，因其组织结构质地太硬，组织中存有的钙盐会妨碍使用常规方法制作良好切片，经固定后，必须除去钙盐使组织软化，方能进行常规切片。

骨组织含钙量最多，所以脱钙是制作骨组织切片的重要环节，尤其需要进行免疫组化的骨组织。

为了达到骨组织既充分脱钙，又保护骨组织的抗原不受破坏，需对骨组织固定之后再脱钙或采用兼有固定与脱钙的试剂处理，然后才能常规制片。

一、骨脱钙方法

常见的脱钙方法主要有单纯酸类脱钙法、混合酸类脱钙法以及有机螯合剂法。

单纯酸类脱钙法：

主要有甲酸、硝酸、盐酸等，硝酸和甲酸应用最多。

①   甲酸是一种使用范围较广的脱钙剂，浓度一般10%，脱钙速度较慢，适合骨髓组织脱钙，不适合皮质骨的脱钙。

②   硝酸脱钙液缺点是形成亚硝酸而使溶液呈黄色，产生颜色即迅速影响脱钙速度，且组织的黄染会妨碍随后的染色，可在硝酸内加入0.1%尿素可以防止变黄而使之无色。

③   盐酸脱钙液易使组织收缩，作用速度较快，用氯化钠作为溶剂则效果良好。

混合酸类脱钙法：

两种酸类脱钙剂一起使用，或在单纯酸内加入另一种脱钙剂或少量的其它试剂所配制的脱钙液。

特点是脱钙完全，快速，防止纤维组织过度膨胀，减少组织破坏对染色结果的影响，通过加入不同的化学成分可以弥补单纯酸类脱钙剂的不足。

①   含甲酸脱钙液（甲酸-福尔马林液）

配方：甲酸                 5－25ml

        福尔马林            5ml

        蒸馏水     加至    100ml

5%的甲酸是良好的一种常规脱钙剂，速度适当，组织损害小。当甲酸成分增至25%则增快脱钙速度，加入甲醛可适当保护组织不受酸损害（注意：增加脱钙速度只能靠牺牲细胞微细构造来获得）。根据组织的厚度和钙化程度，5%甲酸在2至4天可以完全脱钙。

②   含盐酸脱钙液（Von Ebnei氏液）

配方：浓盐酸             15ml

氯化钠             7.5ml

蒸馏水    加至   100ml

③   含硝酸脱钙液

配方1：福尔马林              5ml

          硝酸（比重1.41）  7.5－15ml

          蒸馏水    加至       100ml

此配方中甲醛可以部分抑制硝酸的浸软作用，同时具有固定作用，硝酸脱钙迅速，组织不膨胀，掌握好可以直接脱水，不影响染色。不过最好先洗去硝酸。

配方2：硝酸（用0.1尿素稳定）   5－10ml

           蒸馏水           加至       100ml

此配方用作常规脱钙剂，作用迅速，对组织不膨胀，对细胞的保存和染色比前者更好，能适用于多种染色技术，但最好每日早晚更换一次新鲜溶液，一般1-3天完成。

④   螯合剂脱钙

EDTA（乙er胺四乙酸）是用于脱钙的螯合剂。为有机化合物，有结合某些金属的能力，能结合钙盐，15%的溶液即起脱钙作用，组织用此方法脱钙，对组织破坏性小，即放置数月亦不致引起对组织的破坏，对以后大多数的染色技术皆可得到满意结果。

二、骨脱钙步骤

1.取材：将骨组织固定于10%福尔马林24小时后再锯取厚度约0.5厘米骨片。

2.固定：再以10%福尔马林固定2天。

3.将组织置于脱钙剂中，每日更换新鲜液、直至组织软化为止。

4.流水冲洗24小时/2%亚硫酸钠水溶液中和，至少3小时，水洗至少1小时（除酸）。

5.进行常规脱水，透明，浸蜡，切片。

三、鉴定脱钙是否彻底

确定脱钙“终点”有以下三种方法：

1. 最常用的是最简单的方法――针刺，如果很容易被刺透，而且不感到阻力时，说明组织基本上脱钙完全，否则应继续脱钙。

靠组织的柔软性测验脱钙作用靠不住，而且这种插入一根针以察觉钙沉淀的方法会造成组织损伤。

2．用X射线检查：看组织内是否仍有钙质。
 

3．用化学实验检查：

取5ml脱钙液用2M的NaOH（氢氧Hua钠）调整至中性，再加5％草酸钠或草酸铵1ml，液体混浊表示有钙质。迟至5分钟仍不混浊表示脱钙液中不含有钙质。

组织中仍有钙质时，一定量的钙离子会溶于脱钙液中，游离的钙会干扰脱钙作用的完成。显然，应在每次试验时完全更换，在试验中必须经过2－3小时间隔让钙溶解。

四、优质脱钙剂的标准

（a）完全脱钙；

（b）不损伤组织细胞或纤维；

（c）不妨碍以后的染色技术；

（d）适当的脱钙速度。