众所周知，EVs 可以装载的药物包括化疗药物和核酸，例如信使 RNA（ mRNA）， miRNA，小干扰 RNA（ siRNA）和小核仁 RNA（ snoRNA）。 EVs 的来源，分离方法，标记方法以及给药途径都会影响药物递送。分离出 EVs 后，可以通过物理或者化学法装载药物的方法有： 超声法、混和共培养、电穿孔、冻融循环、挤压、皂素透化、转染试剂（包括脂质体）、Cacl2。外泌体载药问题解答：
1. 研载生物能提供哪些方法的载药服务呢？
答：超声法、混合共培养法、冻融循环、挤压、皂素透化、转染试剂（包括脂质体）、CaCl2这些方法均可实现，常用方法有以下三种：
①基于超声的药物加载方法，使用超声探头施加超声能量，从而降低 EV 膜的刚性，实现药物扩散；②混合共培养法载药；③脂质转染试剂（ Lipofectamine），通过利用阳离子物质促进与脂质膜的相互作用和随后的内在化，可有效将核酸加载到 EVs 内部。
2. 研载生物可以利用这些方法使外泌体负载哪些类型的药物呢？
答：①小分子药物紫杉醇、阿霉素、紫草素等；②核酸有miRNA、siRNA等；③质粒；④多肽；⑤壳寡糖等大分子；⑥Lamp2b（溶酶体相关膜蛋白2），Mapk1（促分裂原活化蛋白激酶1）。等等。
3. 研载生物能提供哪些外泌体载药后的检测服务呢？
答：①高效液相色谱（HPLC）：检测小分子药物装载效率；
②荧光分光光度计检测：通过荧光分光光度计 F-4600在 594 nm 和 480 nm 激发下检测 Dox 的内在荧光，对装载 Dox 的外泌体进行量化；
③共聚焦或流式检测荧光标记：对装载的外来物进行荧光标记，例如miRNA-CY3（CY3为红色荧光标记），外泌体进行绿色标记，通过荧光观察绿色标记外泌体中红色荧光比例或流式检测，均可以说明装载效果。
④qPCR检测：对于miRNA，通过qPCR检测miRNA表达水平；对于siRNA，通过qPCR检测敲低效率。
⑤western blot检测：对于miRNA，通过western blot检测靶蛋白的表达水平；对于siRNA，通过western blot检测敲低效率；
⑥透射电镜、外泌体粒径检测：鉴定药物是否装载，但效率不能用该方法评估。
此外，您如果有文献参考的其他装载及检测方法，研载生物可对其进行评估确定是否具有可操作性。
研载生物为您解读一篇发表 在Nanomedicine 杂志上的《Development of Exosome-encapsulated Paclitaxel to Overcome MDR in Cancer cells》表一：EVs 药物递送效率评估（发表文献举例）
表二：基于 EVs 的的癌症治疗药物递送示例
该研究提出了基于外泌体作为药物运载工具的可能性，从而提高化疗药物紫杉醇对耐药肿瘤细胞的治疗效果。因此，该研究利用巨噬细胞分泌的外泌体，寻找并比较了各种外泌体运载紫杉醇（exoPTX）的方法，进而对这个外泌体-紫杉醇复合物的大小、稳定性、药物释放以及抗肿瘤效果进行了描述。该研究还发现，对外泌体的膜结构进行超声处理会提高外泌体的最大药物承载量并有持续的药物释放。重要的是，外泌体包被紫杉醇会对耐药细胞系 MDCK MDR1 (Pgp+) 增加超过50倍的细胞毒性。然后，该研究在小鼠 Lewis 肺癌转移模型中发现该运载外泌体与肿瘤细胞有几乎完全的共定位，并在小鼠模型中有潜在的抗肿瘤效应。因此，该研究得出结论，利用外泌体运载紫杉醇（exoPTX）的方法，可能对各种耐药肿瘤细胞有着很好的潜在化疗效果。
1、外泌体 PTX 载药步骤
将纯化的外泌体（〜10^11粒子）与 PTX 或 DOX 在 1 mL PBS 中混合，分别在室温下孵育（RT），电穿孔和超声处理进行载药。
温育方法：将混合物在 37℃ 摇动温育 1 小时。
电穿孔方法：将外泌体与 PTX 混合，添加到冷却的 4 mm 电穿孔比色杯中，用 Eppendorf Eporator 在 1000 kV 下电穿孔混合物 5 ms，37°C 温育 30 分钟以恢复外泌体膜。
超声处理方法：对外泌体混合物进行超声，超声处理后，在 37°C 下孵育 60 分钟，恢复外泌体膜。
通过高效液相色谱（HPLC）方法测量装载到外泌体中的药物含量：将新鲜制备的 exoPTX置于 PBS中室温下搅拌，不同时间点采集样品，并通过 HPLC 进行分析。
2、PTX 外泌体制剂的表征结果图1. PTX 外泌体制剂的表征
图2.通过 HPLC 评估掺入外泌体的 PTX 量
3、外泌体和外泌体结合的 PTX 在癌细胞中的积累图 3.外泌体在 3LL-M27 细胞中的大量积累
图4. exoPTX 制剂的稳定性从 Raw 264.7 巨噬细胞释放的外泌体加载 PTX，并在一个月的时间内分别在 4°C，室温和 37°C 下测量纳米颗粒的大小，都没有发现 exoPTX 尺寸的明显变化。
4、不同 PTX 制剂在癌细胞中的细胞毒性图5.不同 PTX 制剂在癌细胞中的细胞毒性图6..在体外癌细胞系中空的超声处理的外泌体没有细胞毒性作用
5、exoPTX 细胞毒性作用的机理研究 图7.
在室温下孵育时，R123 不会掺入外泌体 游离 R123 的释放时间比外泌体的释放时间晚得多。
图8.外泌体不抑制抗性癌细胞中 Pgp 介导的药物外流
6、外泌体在具有肺转移的小鼠中的生物分布 图9. Lewis 肺癌（3LL-M27）的肺转移模型
在荷瘤肺（A）和肺切片（B）的 HE 图上检测到多个转移（箭头）。
图10.气管输送的 exoPTX 与肺转移瘤的共定位
共聚焦图像显示外泌体与肺癌转移细胞几乎完全共定位（黄色）。
图11.气道输送的exoDox与肺转移瘤的共定位
共聚焦图像显示外泌体递送的 Dox 与转移灶显示共定位（黄色）。
7、exoPTX 对肺转移的治疗功效图 12. exoPTX 处理后对小鼠肺转移瘤生长的抑制
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