一、技术简介circRNA(环状RNA)是一类特殊的非编码RNA分子,主要位于细胞质或储存在外泌体中,广泛存在于真核生物中,来源于基因的外显子或者内含子区域,在哺乳动物细胞中大量存在。与传统的线性RNA不同,circRNA没有5’帽子和3’poly(A)尾巴结构,呈封闭环状结构,不受RNA外切酶影响,表达更稳定,不易降解。circRNA由于其表达的特异性和调控的复杂性,以及在疾病发生中的重要作用越来越受到大家的重视。就像miRNA和长链非编码RNA一样,circRNA已经成为RNA领域的一个研究热点。 二、实验流程1.琼脂糖凝胶电泳实验分别用Divergent primer 和Convergent Primer 检测cDNA样品和gDNA样品。对照组为GAPDH。分别使用Divergent Primer和Convergent Primer在cDNA和gDNA中检测circRNA和GAPDH。在cDNA中以Divergent Primer能检测到对应大小的条带,与Convergent Primer检测到的条带大小不同;在gDNA中以Divergent Primer检测不到对应大小的条带,表明circRNA是反向成环的。2. R Nase R实验分组:加入R Nase R的消化组和不加R Nase R的对照组实验:检测上述circRNA和对应的母本基因(mRNA)表达量。3.Sanger 测序Sanger测序确认circRNA的 Splice Junction序列,将PCR的扩增产物进行sanger测序实验。 三、参考案例
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