Illumina 公司的Solexa 测序技术为广大用户提供了强大的高通量测序方法,上海伯豪生物技术有限公司(上海生物芯片有限公司全资子公司,生物芯片上海国家工程研究中心),利用Solexa系统为目前遗传分析和功能基因组等热门研究领域的热门课题提出了全新的应用方案。
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Solexa高通量测序技术特点:
可扩展的超高通量:Genome Analyzer系统目前每次运行后可获得超过20GB的高品质过滤数据。这个技术的可扩展性保证了更高的数据密度和输出,能用更少的经费完成更复杂的项目。到今年底,通量还有望上升到95 GB,相当于人类基因组的30倍覆盖度。
需要样品量少:Genome Analyzer系统需要的样品量低至100ng,能应用在很多样品有限的实验(比如免疫沉淀、显微切割等)中。这也是很多研究人员所考虑的因素。
简单、快速、自动化:Genome Analyzer 系统提供了最简单和简洁的工作流程。即使是最小的实验室也能像大型基因组中心一样进行大规模的实验。制备样品文库可以在几小时内完成,一个星期内就能得到高精确度的数据。Cluster Station可以说是Genome Analyzer的核心。由独立软件控制的自动生成DNA簇的过程可以在5小时之内(30分钟手工操作)完成。这个自动化的流程不需要进行Emulsion PCR,减少了手工操作误差和污染可能性,也不需要机器人操作或洁净室。快速的实验流程使Genome Analyzer的能力增至最大,而自动化步移降低了项目的时间和费用。
新颖的测序化学技术:Genome Analyzer通过合成测序来支持大规模并行测序。利用新颖的可逆荧光标记终止子,可以在DNA链延伸的过程中检测单个碱基掺入。由于四个可逆终止子dNTP在每个测序循环都存在,自然的竞争减少了掺入的误差。
单个或配对末端支持:Genome Analyzer 系统支持单个片段或配对末端文库。文库构建过程简单,减少了样品分离和制备的时间。制备基因组DNA的单个片段或配对末端文库需要6个小时,只有3个小时需要手工操作。2×50个碱基或更长的读长增加了比对基因组的能力,并拓展了在其他方面的应用。
Solexa 高通量测序原理
Solexa 方法是利用单分子阵列测试 genotyping ,此种测序法首先是将 DNA 从细胞中提取,然后将其打断到约 100 - 200bp 大小,再将接头连接到片段上,经 PCR 扩增后制成 Library 。随后在含有接头的芯片( flow cell )上将已加入接头的 DNA 片段绑定在 flow cell 上,经反应,将不同片段扩增。在下一步反应中,四种荧光标记的染料应用边合成边测序的原理,在每个循环过程里,荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。互补的核苷和核苷酸片断的第一个碱基配对,通过酶加入到引物上。多余的核苷被移走。这样每个单链 DNA 分子通过互补碱基的配对被延伸,利用生物发光蛋白,比如萤火虫的荧光素酶,可通过碱基加到引物后端时所释放出的焦磷酸盐来提供检测信号。针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记,这个标记会释放出荧光。荧光信号被 CCD 采集, CCD 快速扫描整个阵列检测特定的结合到每个片断上的碱基。通过上述的结合,检测可以重复几十个循环,这样就有可能决定核苷酸片断中的几十个碱基。
Solexa 的这种方法,可在一个反应中同时加入 4 种核苷的标签,采用边合成边测序(SBS - sequencing by synthesis),可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。并具有所需样品量少,高通量,高精确性,拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点,此反应可以同时检测上亿个核苷酸片断 , 因此在同一个芯片或几个芯片上花费很少(只需常规方法的 1 %)的成本就可测试全基因组。
实验流程
1. 文库制备
将基因组DNA打成几百个碱基(或更短)的小片段,在片段的两个末端加上接头(adapter)。
2. 产生DNA簇
利用专利的芯片,其表面连接有一层单链引物,DNA片段变成单链后通过与芯片表面的引物碱基互补被一端“固定”在芯片上。另外一端(5’或3’)随机和附近的另外一个引物互补,也被“固定”住,形成“桥 (bridge) “。反复30轮扩增,每个单分子得到了1000倍扩增,成为单克隆DNA簇。DNA簇产生之后,扩增子被线性化,测序引物随后杂交在目标区域一侧的通用序列上。
3. 测序
Genome Analyzer 系统应用了边合成边测序(Sequencing By Synthesis)的原理。加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。 这些核苷酸是“可逆终止子”,因为3’羟基末端带有可化学切割的部分,它只容许每个循环掺入单个碱基。此时,用激光扫描反应板表面,读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。之后,将这些基团化学切割,恢复3’端粘性,继续聚合第二个核苷酸。如此继续下去,直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样,统计每轮收集到的荧光信号结果,就可以得知每个模板DNA片段的序列。目前的配对末端读长可达到2×50 bp,更长的读长也能实现,但错误率会增高。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响,如荧光标记的不完全切割。
4. 数据分析
自动读取碱基,数据被转移到自动分析通道进行二次分析。
Selexa高通量测序服务价格
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