Ion Torrent 16S rDNA分子生态测序 - 伯豪生物解决方案
微生物分子生态学研究（Microbial Phylogeny Study）研究利器

      随着生物技术的飞速发展，传统的微生物鉴定方法常常难以鉴定众多的生长习性复杂的微生物，因而基于基因组序列的分子鉴定受到广泛关注。在细菌基因组中，编码 16S rRNA 的 rDNA 基因具有良好的进化保守性，适宜分析的长度（约为1540bp），以及与进化距离相匹配的良好变异性，所以成为细菌分子鉴定的标准标识序列。16S rDNA的序列包含9或10个可变区（variable region）和11个恒定区（constant region）。保守序列区域反映了生物物种间的亲缘关系，而高变序列区域则能体现物种间的差异。16S rDNA分子的序列特征为不同分类级别的近缘种系统分类奠定了分子生物学基础。目前16SrDNA的序列信息已经广泛应用于菌种鉴定和系统发生学研究。

     上海伯豪利用Ion Torrent平台为您提供Ion Torrent 16s rDNA分子生态测序，帮助您更高效、快速地进行微生物分子生态研究。


研究内容：

16s rDNA的不同可变区测序
各种环境的菌群结构分析

技术路线：

数据结果：

结果报告内容：数据质量评估报告；有效数据统计结果；对reads 聚OTU，并进行物种注释；单样品复杂度的Alpha diversity分析；物种（或OTU）丰度分析；Beta diversity分析；主成分分析（PCA）结果（样品数 ≥ 3）；聚类分析结果（样品数 ≥ 3）；筛选与样品分组显著相关的因子（物种、OTU）。
Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) 16s rDNA测序是下一代测序基础上微生物研究领域的应用。其对对微生物16s rDNA测序，首先得到的原始图像文件，然后经过碱基识别及误差过滤，最终得到可以用于分析的原始测序片段，我们称之为Reads，它包括序列的碱基组成信息以及其对应的序列质量信息。


测序结果部分展示：

测序序列质量评估

评估原理：应用测序质量Q值进行评估，Q值与测序错误E值之间关系为：

评估方法

Q值盒图统计：

盒图即是质量分位图，黄色长方形最下面的边为占25%比例的，质量Q值，依此往上分别为占50%比例，占75%比例对应的质量Q值，上下的黑线代表占90%和10%对应的质量值，蓝色的线表示质量数值的平均值、绿色背景部分代表高质量数值部分、橘色背景部分代表合理质量数值部分、红色背景部分代表低质量数值部分。

图 quality statistics

横坐标为reads的碱基位置，纵坐标为所有reads在每个位置上的质量(Q: 0~40)分布。此为一个样本双端测序结果综合示例。

数据预处理
     本步骤将利用引物设计序列，以此来确认真实有效的16s rRNA 序列片段。这里我们选取两头皆为正确引物序列的reads 作为clean reads 进行分析。

各样品物种分类
     使用mothur(version: 1.31.2)工具的“classify.seqs()”方法对每个样品进行物种分类鉴定，去除Mitochondria，Chloroplast，Eukaryota，和unknown（未在数据库中检索到）的结果。随机取样bootstrap 阈值设置为80%。

     使用的数据库是RDP training set (v9)，下载地址为： http://www.mothur.org/w/images/5/59/Trainset9_032012.pds.zip

     选取某一分类层次上物种分类绘图。这里选取分类为第二层。图中显示的比例指该物种分类在各样本中的序列数目占该物种分类所有序列数目的百分比。

各样品OTU及丰度和分类
     使用“mothur”工具通过与GreenGene数据库比对，生成OTU，并计算各个OTU在每个样品中的丰度及物种分类，去除Mitochondria，Chloroplast，Eukaryota，和unknown（未在数据库中检索到）的结果。

样品丰富度稀疏曲线
     接下来使用sobs 算法对各样本进行随机抽样并计算OTU 的数目丰富度。据此，最终绘制丰富度(richness)稀疏曲线。横坐标为抽样序列数目， 纵坐标为抽样序列中的OTU 的数目。

相似性水平为0.03 的各样本OTU 数目的稀疏曲线

香农指数

     计算各样本香农(shannon)指数。绘制多样性(alpha-diversity)曲线横坐标为抽样序列数目，纵坐 标为对应的香农指数。


Rank-Abundance 曲线

     根据各样品的OTU 丰度和排序做Rank-Abundance 曲线。


组间韦恩图

     根据以上OTU 在各样本中的分类信息绘制韦恩(venn diagram)图。交叉的部分指相邻样品共同的OTU。


群落相似度分析

    根据各样品OTU 组成和丰度的差异，计算样品间的相似度，绘制相似度树。

上海伯豪Ion Torrent服务介绍：

      Ion Torrent平台采用了半导体技术和简单的化学试剂进行DNA测序，而不是使用光作为媒介。在半导体芯片的微孔中固定DNA链，随后依次掺入ATCG。随着每个碱基的掺入，释放出氢离子，在它们穿过每个孔底部时能被检测到，通过对H+的检测，实时判读碱基。

     上海伯豪利用中低通量的Ion Torrent PGM Systems和中高通量的Ion Torrent Proton Systems，为广大科研工作者提供Ion Torrent测序相关服务。

Ion Torrent技术优势：

更准确：系统无激光光源，无化学系统，无照相系统；使用无标记的核苷酸及酶进行测序，本底干扰低。通过对H+的检测，明显改善碱基判读准确性。
更快速：最短测序时间仅为2-3小时，24小时之内可完成6-8轮实验；达Sanger测序方法每天测序通量的数千倍以上；弥补了已有高通量测序方法“无快速测序模式”的缺陷。
更灵活：可满足不同通量的测序需求。

技术原理：

1、脱氧核苷酸分子流过芯片微孔；
2、如果脱氧核苷酸与微孔中的DNA分子互补，则该核苷酸被合成到DNA分子中，并且释放氢离子，该孔溶液的PH发生变化；
3、感应层检测到PH变化；
4、感应层将PH变化的化学信息转变为电压变化信息；
5、电压变化信息转变为数字电子信息。如果DNA链含有两个相同的碱基，则记录电压信号是双倍的。如果碱基不匹配，则无氢离子释放，也就没有电压信号的变化。

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