一、数据分析流程

二、数据分析内容

1. 数据预处理

目的：对原始测序数据进行一定程度的过滤。
原理：根据测序接头以及测序质量对原始的测序数据进行预处理，其中，测序质量Q与测序错误E之间的关系如下：

结果：对预处理后质量以及碱基分布统计进行统计

2. UniGene拼接

目的：将预处理后reads进行拼接，得到拼接结果。
原理： 应用 de Bruijn graph path 算法对reads进行denovo拼接；对上一步的拼接结果，再用Hamilton Path算法拼接。
结果：UniGene序列，UniGene统计信息，序列长度分布图

3. 数据库注释

目的：对拼接得到的UniGene进行功能注释
原理：通过blast+算法将拼接得到的UniGene序列与数据库进行比对
结果：比对结果表格，物种分布统计和Evalue分布统计

4. UniGene表达分析

目的：UniGene定量分析。
原理：以UniGene为reference，分别将每个样本的reads进行reference mapping ,从而得到每个样本在每个UniGenes中的一个reads覆盖度，然后应用RPKM/FPKM标准化公式对富集片段的数量进行归一化。
RPKM：Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads，公式下:

FPKM：Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped reads，公式下:

UniGene表达分布图，1X，5X分别为FPKM=1，FPKM=5分界点，可以大体观察到低表达，中表达以及高表达的比例关系

UniGene样本间表达相关性散点图

样本间表达差异程度的MA图，可以体现差异表达总体偏差

5. UniGene表达差异分析

目的：对定量结果进行统计检验分析，找出差异表达UniGene
原理：双层过滤筛选差异基因
FC值筛选：采用Fold-change(FC)，表达差异倍数进行层次的差异基因筛选
FDR检验：一般采用卡方检验中的fisher精确检验进行p值检验，采用Benjamini FDR(False discovery ratio)校验方法对p值进行假阳性检验，即，通过FDR显著性参数进行第二层次的差异基因筛选。
结果展示：

组间差异基因上调与下调个数统计，可以通过此图观察上调与下调的一个总体趋势

差异基因火山图，可以观察到差异基因总体分布

6. GO功能分类
目的：利用数据库注释信息将 UniGene进行 GO 功能分类。
原理：利用数据库的注释结果，应用blast2GO算法进行GO功能分类，得到所有序列在Gene Ontology 的三大类：molecular function, cellular component, biological process 的各个层次所占数目，一般取到14层。
结果：MF，BP，CC三大分类结果文件以及 UniGene2GO 关系列表，三大类别中第二层次上的柱状分布图和饼图，GO功能的层次分布图。

7. KEGG代谢通路分析

目的：对拼接得到 UniGene 进行 KEGG pathway 映射。
原理：应用KEGG KAAS在线 pathway比对分析工具对拼接得到的UniGene进行KEGG映射分析。
结果：标记的Pathway通路图。

8. COG注释

目的：对拼接得到 UniGene 进行 COG功能分类。
原理：利用blast+算法将拼接得到的UniGene与CDD库中的COG/KOG库进行比对，进行COG功能分类预测，将其映射到COG分类中。
结果： COG分类分布情况图。

9. SSR重复序列注释

目的：对拼接得到 UniGene进行 SSR 简单重复序列的查找。
原理：筛选标准：单核苷酸重复的次数在10次或10次以上，二核苷酸重复的次数在 6次或6次以上，三至六核苷酸重复的次数在 5次或 5次以上。同时，也筛选中间被少数碱基 (间隔小于100或等于100)打断的不完全重复的SSR。
结果：重复序列的信息文件以及统计文件。

10. LncRNA预测

目的：对拼接得到的UniGene进行LncRNA(Long noncoding RNA)预测。
原理： 通过以下过程对UniGene进行过滤，最终得到候选LncRNA序列。
1) Unigene length > 200bp；
2) Unigene ORF(Open Reading Frame) length < 300；
3) 将满足长度条件的UniGene与多个近源物种进行进化分析，得到序列的保守性和进化特性；
4) 根据上述的特性和已知数据库中coding、noncoding区域的特性建立编码筛选模型；
5) 将符合noncoding模型的UniGene与Pfam等蛋白域数据库进行同源性比对，进一步去除可能的编码特性，最终得出LncRNA预测结果。

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