1. 数据预处理

测序得到Raw Reads中可能含有总体质量较低、含有测序引物、末端质量偏低等不合格的Reads，这些不合格的Reads很有可能对分析质量造成一定的影响，所以必须对其进行过滤，得到可用于数据分析的clean Reads，应用fastx（version:0.0.13）[1]进行过滤，主要步骤如下：

1) 去除总体质量偏低的reads，将质量大于20碱基所占比例小于50%的reads去除
2) 去除3’端质量Q低于10的碱基，即碱基错误率小于0.1，其中，Q=-10logerror_ratio
3) 去除reads中所含有的接头序列
4) 去除reads中含有的模糊的N碱基，是由于测序强度不够,机器无法识别的碱基
5) 去除长度小于20的reads
6) 去除所属物种的ribosome RNA reads

结果统计如下表：

表1 数据预处理结果统计

备注：Clean ratio=(Clean reads/Raw reads)%

数据量计算方法：33,578,010reads=34M reads=34*100/1000G bases=3.4G bases

2. 基因组比对（Mapping genome）
应用tophat（version:2.0.9）[2]的spliced mapping算法对预处理后的reads进行Genome mapping，这种算法允许将不能全长匹配的reads分割进行mapping，较适用于真核(有内含子间区)转录组测序数据。

Mapping统计如下表：

表2 基因组比对结果统计

Reads比对到基因各个区域的比例如下图所示：

图1 Regions distribution。展示了测到的reads比对到基因区、编码区、剪接位点、内含子和非编码区的比例。

备注：其中non-coding region包括5UTR、3UTR、non-coding RNA regions等总的非编码区域的统计。

各个样本的基因组覆盖情况如下图所示：

图2 基因组覆盖分布图。以1K的窗口得出基因组的一个覆盖分布，图中最外圈为基因组，里面每一个圈表示一个样本的染色体覆盖。

3. 饱合度分析

分析被测到的基因数目随着测序量的增加而增加的曲线。

图3 饱和度分析图。横坐标为测序的数据量；纵坐标为覆盖到的基因数目可以说明测序数量是否足够。

4. 基因表达分析
4.1 基因水平表达定量

在转录组测序中，我们可以通过mapping到基因区域的reads数目来估计基因表达的水平，但reads数除了与基因表达水平成正比外，还与基因本身的长度、测序的数据量有关。为了使不同基因、不同样本间的基因表达水平具有可比性，将reads转化成RPKM值进行基因表达量的标准化。我们应用cufflinks（version:2.1.1）对tophat的mapping结果进行基因表达定量。

基因表达定量分析结果如下：

表头说明：



4.2 表达相关性分析

根据基因表达定量的结果分析样本之间总体的相关性，包括PCA分析，相关性heatmap图。

图4基于基因表达的样本PCA图

图4 基因表达相关性heatmap图。颜色越深表明相关性越大，数值指相关性系数。

4.3 基因差异表达分析
应用cufflinks（version:2.1.1）中的Cuffdiff将归一化得到的FPKM值进行样本间差异基因分析。采用FoldChange(表达差异倍数)以及Fisher-test精确检验统计学方法对差异基因差异程度进行筛选，筛选条件如下：
1) FDR <= 0.05
2) Fold-change>=2 

差异表达基因详细信息如下：

表头说明：

样本的表达分布图、样本间的表达相关性图，以及差异基因的火山图和Heatmap图如下：

图5表达分布图。可以观测出基因表达的分布情况以及高丰度基因、低丰度基因的一个构成，如果数据量足够，则表达分布图则出现两个较为明显的峰。

图6 表达相关性散点图。可以校验两个样本的相关性程度，如果相关性很低，则说明可能在建模或者实验方面存在问题，其中：红色表示上调差异基因，绿色表示下调差异基因。

图7火山图。红色表示上调显著性差异基因，绿色表示下调显著性基因，其中：两条竖蓝色表示表达差异倍数为2倍，一条横蓝色表示P=0.05。

图8Heatmap图。

5. 差异基因富集分析

5.1 差异表达基因的GO 富集分析

把所挑选的差异表达基因向Gene Ontology数据库的各个条目（term）映射，计算每个条目的基因数目，然后应用超几何检验，与整个基因组背景相比，筛选在差异表达基因中显著富集的GO条目。

差异基因GO富集分析结果如下：

表头说明：

差异基因GO富集分析图形化展示如下：

图9 差异表达基因GO富集柱状图

5.2 差异表达基因的KEGG 富集分析
应用GO富集原理同样可以得出具有富集功能的KEGG pathway。

差异基因KEGG富集分析结果如下：

表头说明：

差异基因KEGG富集分析图形化展示如下：

图10 差异表达基因KEGG富集柱状图

同时报告中会给出Pathway通路图，包括网页文件及静态JPG，单击可访问KEGG中相应的基因说明页面。

图11 差异表达基因KEGG富集柱状图

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