蛋白质的二硫键定位

原理：经过对Cys的完全还原修饰（DTT/IAA）或不完全还原修饰（TCEP）与不修饰的对比，酶解后用串联质谱法（MS2）对含有二硫键的肽段的b离子/y离子分析，确定蛋白质中二硫键的位置。

仪器：Finnigan LCQ Deca XP / Finnigan LTQ

样品要求：

含盐量：挥发性无机盐<20mM；不挥发性无机盐<5mM；样品蛋白质总量>10nmol；样品纯度>90%；样品应尽量保持其纯度不要添加任何保护剂或其他物质。

实例分析：
某样品二硫键定位分析
理论的二硫键配对情况：Cys6-Cys34和Cys104-Cys144

 

 

Fig1：肽段GSGGGCDLPQTHSLGNR的MS/MS图谱。样品经过酶解还原后鉴定。

Fig2：肽段ISPFSCLK的MS/MS图谱。样品经过酶解还原后鉴定。

Fig3：肽段FYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSILAVR的MS/MS图谱。样品经过酶解还原后鉴定。

Fig4：肽段YSPCAWEVVR的MS/MS图谱。样品经过酶解还原后鉴定。

Fig5：对应于FYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSILAVR和YSPCAWEVVR形成二硫键后的肽段的full scan图谱。样品经过酶解还原后鉴定。

实验结果及分析：

1）  非还原的Trypsin酶解质谱分析中，没有发现带Cys的肽段；

这些肽段（GSGGGCDLPQTHSLGNR；ISPFSCLK；YSPCAWEVVR；FYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSILAVR）在对应的还原的Trypsin酶解质谱分析中都被发现，那么可以推测待检测样品没有自由的Cys，可能形成了两对二硫键。

2）  非还原的Trypsin酶解质谱分析中。质荷比M/Z1817.8(+3)/1363.7(+4)/1091.6(+5) (对应于YSPCAWEVVR和FYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSILAVR形成二硫键后的肽段)被发现；而在还原的Trypsin酶解质谱中这些没能发现。那么通过Fig3，4，5可以确定二硫键Cys104-Cys144；考虑到样品形成了两对二硫键，那么通过Fig1，2可以推测二硫键Cys6-Cys34