地高辛配基随机标记DNA探针

1.标记DNA探针　每次标准的反应可标记10ng至3μg线性的DNA，也可标记更大量的DNA，但所有的成分和体积要相应增加。

(1)DNA探针热变性，煮沸10min，迅速冷却于冰/乙醇中5min以上，待用。

(2)取Eppendorf管(1.5ml)置于冰上，加下列及试剂：

新鲜变性的DNA 　　　　　　　　　1-3μg

六聚核苷酸混合物 　　　　　　　　2μl(管5)

dNTP标记用混合底物 　　　　　　　2μl(管6)

加无菌重蒸水至　　　　　　　　　 19μl

DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow)　　　1μl(管7)

(3)在37℃保温至少60min，可到20h。

(4)煮沸5min，终止反应。

(5)15000rpm离心30s，置于冰上待用。

2.预杂交　按100cm2膜用20～40ml预杂交溶液，预杂交时使溶液处于流动状态。

预杂交液组成：5×SSC

0.5%(W/V)封阻试剂(管11)

0.1%(W/V)N-十二烷酰肌氨酸钠

0.02%(W/V)SDS

膜放入塑料袋，灌入预杂交液，排除气体后密封，在65℃预杂交过夜。

3.杂交　按100cm2膜用2.5ml杂交液，杂交时偶尔摇动杂交袋，使里面的溶液重新分配。

杂交液组成： 50%甲酰胺(V/V)

5%(W/V)封阻试剂

5×SSC

0.1(W/V)N-十二烷酰肌氨酸钠

0.02%(W/V)SDS

新变性标记DNA(150ng/ml)

杂交液取代预杂交液，替换间膜不能干，成功地替换应是膜与塑料袋间形成一层杂交液膜。于42℃杂交过夜(16～20h)。

4.洗膜　　按100cm2膜用250ml洗膜液计算。

(1)在室温下用2×SSC/0.1%(W/V)SDS溶液漂洗，5min，2次。

(2)在65℃条件下用0.1×SSC/0.1%SDS溶液漂洗，10min，2次。

(3)在室温下用2×SSC溶液漂洗1次。

5.免疫测定

(1)配制溶液

缓冲液1：Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L)pH7.5(20℃)

缓冲液2：0.5%(W/V)封阻试剂(管11),配制于缓冲液1中(封阻试剂不会快速溶解,因此应预早1h前配制此溶液,将试剂溶于50～70℃,此溶液保持混浊)。

缓冲液3：Tris-HCI(100mmol/L);NaCI(100mmol/L);MgCI2(500mmol/L)pH9.5(20℃)。

缓冲液4：Tris-HCl(10mmol/l);EDTA(1mmol/L);pH8.0(20℃)

显色溶液：新鲜配制，在10ml缓冲液3中，加45μlNBT溶液(管9)和35μlX-磷酸盐缓冲液(管10)。

2. 显色过程

A.膜在缓冲液1中短暂洗涤(1min)。

B.在100ml缓冲2中保温30min。

C.再用缓冲液1短暂洗涤。

D.用缓冲液1稀释的抗体结合物(管8)至150U/L(1:5000);稀释后的抗体结合物在4℃只能稳定12h。

E.膜在20ml稀释的抗体结合物溶液中保温30min。

F.用100ml缓冲液1洗膜,以除去未结合的抗体结合物,15min,2次。

G.膜在缓冲液3中平衡2min。

H.在黑暗条件下,膜与10ml显色溶液放入塑料袋内密封或放入合适的盒子内,几分钟内开始出现颜色,一般显色反应在1天后全部完成。当颜色显影时，不可振荡或搅拌。

I.当要求的点或带已被检测时，可用50ml缓冲液4洗膜5min终止反应。

J.摄相。

说明：上述各反应均在室温下进行，除了显色反应外，均需振荡或搅拌。

(五)排除实验中问题的方法

1.DNA不能有效地被标记时考虑

(1)用酚/氯仿抽提和/或乙醇沉淀，重新纯化DNA。

(2)标记反应的保温时间延长(增至20h)。

(3)DNA变性或许不完全，这时对大片段DNA特别重要。

2.不能达到预期的灵敏度时考虑

(1)DNA标记率。

(2)增加标记DNA的浓度或增加杂交时间。

(3)显色反应的时间可延长至3d。

3.若显色时背景过深，可采取

(1)在杂交溶液中减少标记DNA量。

(2)增加杂交溶液的体积，使膜随意漂浮在溶液中。

(3)某些类型的尼龙膜可能产生深色背景，因此可采用其它类型的尼龙膜或改用硝酸纤维素膜。

(4)在杂交和检测过程中增加封阻试剂的浓度。