摘要：介绍了一种双波长分光光度法，应用于测定油菜蜂花粉中的总黄酮含量，测定波长510nm，参比波长584nm，平均回收率98.2%，RSD=1.23%(n=5).结果表明，青海产油菜蜂花粉中总黄酮平均含量为3.22%，该方法稳定可靠.重现性好.
油菜(Brassica campestris L.)为十字花科，芸苔属植物.由蜜蜂采集的油菜花粉——蜂花粉，包含了花蜜和蜜蜂的唾液，富含包括黄酮类物质在内的多种营养成分，在营养、保健、化妆品、医疗等领域得到广泛的应用.人们对油菜蜂花粉中的氨基酸、蛋白质、维生素、矿物质、脂肪酸、碳水化合物等的研究较多，而对同样具有较高保健、药用功效的黄酮类物质的研究非常缺乏.关于黄酮类物质的定量，一般常采用比色法和HPLC法。HPLC法仪器昂贵，而且标准对照物不易获得，其应用受到一定的限制。比色法方便简单，用于组成单一的标准对照物时，结果准确，但当应用于组成复杂的植物试样时，比如花粉黄酮提取液，由于受到多种物质的干扰，而且底液常常出现混浊现象，因此测定结果明显偏高。为克眼底液强吸收带来的干扰，本文采用双波长分光光度法，分析测定青海产油菜蜂花粉中的总黄酮含量，取得了满意的实验结果，可为油菜蜂花粉资源的综合开发利用提供科学依据。
1 实验部分
1.1 实验材料、试剂与仪器
油菜蜂花粉购自青海省湟中县，家用食品粉碎机粉碎、自然干燥后备用。
芦丁标准对照品溶液，精密称取105℃干燥至恒重的芦丁(中国药品生物制品检定所)27.90mg，95%乙醇溶解、定容l00mL;其它试剂均为分析纯。
UV265型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)。
1.2 花粉总黄酮的提取
通过预试验，发现水提法得到的黄酮量极少，采用醇提法，当乙醇的浓度为95%时，花粉黄酮的提取率最高。所以决定以95%，乙醇为溶剂，采用索氏提取器提取。称取花粉3.000 g，用滤纸包好.放入索氏提取器中，首先加入石油醚，水浴加热回流，脱脂、除蜡，至回流液无色时，分离出石油醚弃去。加入95%乙醇，水浴加热回流12h，抽滤，以95%乙醇洗涤残渣，合并滤液，定容100mL，得花粉总黄酮提取液(试液).
1.3 分析方法
1.3.1显色方法
采用NaN02-Al(NO3)3-NaOH显色体系进行显色分析，分别精密吸取不同量的对照品溶液或试液至25mL容量瓶中，用30%的乙醇稀释至12.5 mL;加入0.7 mL5%NaNO2溶液摇匀，放置5min;加入0.7mL10%Al(NO3)3溶液摇匀，放置6min;加入1mol/L NaOH溶液5mL混匀，以30%的乙醇定容，放置10min;以试剂空白为参比溶液，分别在不同的波长下测定其吸光度.
1.3.2 测定波长和参比波长的选择
分别吸取2.5mL对照品溶液和0.5mL试液，按1.3.1方法显色。在400-700nm范围内进行光谱扫描，得到吸收光谱图。在双波长分光光度法测定单组份时，可以选用显色络合物的最大吸收波长作为测定波长，而吸收光谱下端某一点的波长可选作参比波长，因此，选择510nm作为测定花粉总黄酮含量的测定波长，584nm为参比波长。
2 结果与讨论
2.1 标准曲线的绘制
2.2 回收率试验
2.3 样品测定
精密吸取1.0 mL的花粉黄酮提取试液，按1.3中的方法显色、测定吸光度，由标准曲线计算样品中的总黄酮含量.同时以510 nm为测定波长，进行单波长比色法对比分析.取油菜蜂花粉平行5次总黄酮提取、测定实验，总黄酮含量及测量精密度实验结果。
2.4 讨论
油菜蜂花粉中的总黄酮含量，双波长法的测定结果3.22%明显比单波长测定结果3.67%要低，其主要原因是花粉黄酮提取液在显色分析过程中易出现底液轻度混浊现象，从而造成单波长法的测定结果要高.我们曾想通过以不加显色试剂的试液为空白来进行校正，但由于在加入NaOH溶液后底液混浊现象有明显改善，与试液空白根本不一致， 这样做引起的误差更大.而双波长法能很好地扣除底液混浊等背景干扰，结果准确，精密度好，实验操作简单方便.
参考文献：
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