基于质谱技术蛋白质定量方法的研究进展
上一篇 / 下一篇 2011-09-16 02:04:58/ 个人分类:质谱仪器
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图1 SILAC法标记13C6-Lys基本原理[9]
Figure 1 the basic principles of SILAC with 13C6-Lys.
SILAC法最初是标记哺乳动物的培养基细胞[8],后来渐渐发展到标记细菌[10]、酵母[11]、植物细胞[12]。近来,SILAC标记法结合液质联用技术已在解决生命科学疑难问题方面显示作用,例如,对酵母信息素和干细胞分化过程中磷酸化蛋白的定量,蛋白质之间合成与降解的分析等[13]。SILAC法不但可以用于检测特殊的功能蛋白质在某些生物过程中的动态变化[14~16],而且可以用来描述大脑组织中整体蛋白质组的蓝图[17]。
SILAC法与多种质谱技术相结合应用广泛。2008年,Kruger[18]等结合线性离子阱傅立叶变换高磁质谱(LTQ-FT)将SILAC方法拓展应用于哺乳动物体内,并以三种基因表达缺陷的小鼠为模型进行差异性标记,明确证实了相关组织中相应蛋白质的表达缺失信息。Mann[19]小组将SILAC法结合高分辨LTQ-Orbitrap质谱应用于鼠科胚胎干细胞研究,成功鉴定并定量出胚胎干细胞中的5111种蛋白质,这个数量是以往分析结果的三倍。Olsen等[20]采用SILAC法标记结合LTQ-FT质谱定量研究了HeLa 细胞在表皮生长因子刺激后的蛋白变化,检测到2244个磷酸化蛋白上的6600 个磷酸化位点,其中14%的磷酸化位点在EGF 刺激后有2 倍以上的差异,揭示了HeLa 细胞中的磷酸化蛋白受EGF 影响的一个动态过程。Uitto等[21]运用SILAC法结合基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)定量研究了卵巢癌细胞系中的蛋白表达水平,发现SILAC法具有较高的重现性。
就SILAC的机理而言,以氨基酸为原料的细胞培养基,均可用SILAC法标记(目前多采用精氨酸和赖氨酸标记)。从目前的文献报道来看,SILAC法弥补了质谱在定量方面的局限,与分析和生化处理过程具有很好的兼容性, SILAC法标记效率高、损失小;标记误差低,可靠性高。其不足之处在于:一是只适用于活体培养的细胞,对于生物医学研究中常用的组织、体液等样品难以处理,二是对于动物模型的标记成本太高(表1)。但是,SILAC结合HPLC/MS/MS技术已发展为当前生物医学精确定量蛋白质的最有效方法之一。
表1 蛋白质相对定量方法的比较
方法
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标记的同位素
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标记方式
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优点
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缺点
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参考文献
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凝胶电泳法
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无
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无
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快速简单,易观测,成本较低。
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灵敏度低,难以检测疏水性膜蛋白、低丰度蛋白。
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[3] [4]
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同位素代谢标记法
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12C (13C)
14N(15N)
1H (D)
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体内标记
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标记效率高,误差低,没有放射性。
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仅适用于活体培养细胞,成本较高。
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[8] [9][13]
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同位素亲和标签法
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1H (D)
12C (13C)
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体外标记
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适于多种类型的样品。
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仅适用于含半胱氨酸的蛋白分析,数据检索复杂。
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[22][23]
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酶催化18O同位素标记法
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16O (18O)
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体外标记
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操作简单,副产物少,适于低丰度磷酸化肽段的分析。
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受酶解过程和条件影响较大, 18O原子掺入个数具有不确定性。
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[38][43~45]
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同重同位素标签标记定量法
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12C (13C)
14N(15N)
16O (18O)
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体外标记
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可同时标记四种不同样品,蛋白覆盖率高,定量准确,可信度高。
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样品预处理和酶解过程可能引起平行样品之间有差别,造成结果偏差;成本较高。
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[46][53]
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非标定量法
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无
|
无
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简单易行,无需同位素标记过程。
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仅依据一级质谱和数据模型定量,重现性差,定量不准确;难以检测低丰度肽段。
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[54~57]
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3.2 同位素化学标记法
18O标记法也可与多种质谱配合使用。Fenselau等[41] 应用18O标记结合FT-ICR质谱技术研究了腺病毒蛋白的相对表达水平,利用Q-TOF质谱进行单个碎片离子扫描,鉴定出腺病毒蛋白上的一些修饰位点、氨基酸序列等。Korbel等[42]采用18O标记和Q-TOF质谱结合免疫共沉淀反应来分析红细胞生成素(erythropoietin, EPO)受体依赖的蛋白质,鉴定了187个磷酸化蛋白,并定量分析了89个酪氨酸磷酸化修饰与EPO受体依赖性的动态关系。Sui等[43]建立了一种18O-IPG-IEF-LTQ-FTICR的磷酸化蛋白定量技术,实现了HepG2细胞中磷酸化肽段的有效定性和定量。Sakai等[38]结合LCQ质谱将18O标记法和ICAT法对比,发现18O标记法较ICAT法分辨率高、同位素效应小。
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