生化实验讲义(理论部分)三－－层析技术（一）

3.1 层析技术概述

3.1.1 引言

层析法又称色层分析法或色谱法(Chromatography)，它是在1903-1906年由俄国植物学家M. Tswett首先系统提出来的。他将叶绿素的石油醚溶液通过CaCO3管柱，并继续以石油醚淋洗，由于CaCO3对叶绿素中各种色素的吸附能力不同，色素被逐渐分离，在管柱中出现了不同颜色的谱带或称色谱图(Chromatogram)。

当时这种方法并没引起人们的足够注意，直到1931年将该方法应用到分离复杂的有机混合物，人们才发现了它的广泛用途。

随着科学技术的发展以及生产实践的需要，层析技术也得到了迅速的发展。为此作出重要贡献的当推英国生物学家Martin和Synge。他们首先提出了色谱塔板理论。这是在色谱柱操作参数基础上模拟蒸馏理论，以理论塔板来表示分离效率，定量的描述、评价层析分离过程。其次，他们根据液-液逆流萃取的原理，发明了液-液分配色谱。特别是他们提出了远见卓识的预言：一、流动相可用气体代替液体，与液体相比，物质间的作用力减小了，这对分离更有好处;二、使用非常细的颗粒填料并在柱两端施加较大的压差，应能得到最小的理论塔板高(即增加了理论塔板数)，这将会大大提高分离效率。前者预见了气相色谱的产生，并在1952年诞生了气相色谱仪，它给挥发性的化合物的分离测定带来了划时代的变革;后者预见了高效液相色谱(HPLC)的产生，在60年代末也为人们所实现，现在HPLC已成为生物化学与分子生物学、化学等领域不可缺少的分析分离工具之一。因此, Martin和Synge于1952年被授予诺贝尔化学奖。如今的色层分析法经常用于分离无色的物质，已没有颜色这个特殊的含义。但色谱法或色层分析法这个名字仍保留下来沿用。现在我们简称为层析法或层析技术。

层析法的最大特点是分离效率高，它能分离各种性质极相类似的物质。而且它既可以用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。因此，作为一种重要的分析分离手段与方法，它广泛地应用于科学研究与工业生产上。现在，它在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域都发挥着十分重要的作用。

3.1.2 层析的基本理论

层析法是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同，使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。例如：我们利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异，使其在流动相与固定相之间的分配系数(或称分配常数)不同，达到彼此分离的目的。

对于一个层析柱来说，可作如下基本假设：

1. 层析柱的内径和柱内的填料是均匀的，而且层析柱由若干层组成。每层高度为H，称为一个理论塔板。塔板一部分为固定相占据，一部分为流动相占据，且各塔板的流动相体积相等，称为板体积，以Vm表示。

2. 每个塔板内溶质分子在固定相与流动相之间瞬间达到平衡，且忽略分子纵向扩散。

3. 溶质在各塔板上的分配系数是一常数，与溶质在塔板的量无关。

4. 流动相通过层析柱可以看成是脉冲式的间歇过程(即不连续过程)。从一个塔板到另一个塔板流动相体积为Vm。当流过层析柱的流动相的体积为V时，则流动相在每个塔板上跳越的次数为n:

n =

5. 溶质开始加在层析柱的第零塔板上。根据以上假定，将连续的层析过程分解成了间歇的动作，这与多次萃取过程相似，一个理论塔板相当于一个两相平衡的小单元。

3.1.3 层析的基本概念

1. 固定相：

固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质(如吸附剂，凝胶，离子交换剂等)，也可以是液体物质(如固定在硅胶或纤维素上的溶液)，这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。它对层析的效果起着关键的作用。

2. 流动相：

在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。它也是层析分离中的重要影响因素之一。

3. 分配系数及迁移率(或比移值)：

分配系数是指在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量(浓度)的比值，常用K来表示。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。

K=Cs/Cm

其中Cs: 固定相中的浓度，Cm: 流动相中的浓度。

迁移率(或比移值)是指：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。常用Rf来表示。

实验中我们还常用相对迁移率的概念。相对迁移率是指：在一定条件下，在相同时间内，某一组分在固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移动的距离之比值。它可以小于等于1，也可以大于1。用Rx来表示。不同物质的分配系数或迁移率是不同的。分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件。很显然，差异越大，分离效果越理想。

分配系数主要与下列因素有关：①被分离物质本身的性质;②固定相和流动相的性质;③层析柱的温度。对于温度的影响有下列关系式：

lnK = -(?G0/RT)

式中： K为分配系数(或平衡常数)

?G0为标准自由能变化

R为气体常数

T为绝对温度

这是层析分离的热力学基础。一般情况下，层析时组分的?G0为负值，则温度与分配系数成反比关系。通常温度上升20?C, K值下降一半，它将导致组分移动速率增加。这也是为什么在层析时最好采用恒温柱的原因。有时对于K值相近的不同物质，可通过改变温度的方法，增大K值之间的差异，达到分离的目的。

4. 分辨率(或分离度)

分辨率一般定义为：相邻两个峰的分开程度。用Rs来表示。Rs值越大，两种组分分离的越好。当Rs = 1时，两组分具有教好的分离，互相沾染约2%，即每种组分的纯度约为98%。当Rs=1.5时，两组分基本完全分开，每种组分的纯度可达到99.8%。如果两种组分的浓度相差较大时，尤其要求较高的分辨率。

为了提高分辨率Rs 的值，可采用以下方法：

⑴ 使理论塔板数N增大，则Rs上升。

① 增加柱长，N可增大，可提高分离度，但它造成分离的时间加长，洗脱液体积增大，并使洗脱峰加宽，因此不是一种特别好的办法。

② 减小理论塔板的高度。如减小固定相颗粒的尺寸，并加大流动相的压力。高效液相色谱(HPLC)就是这一理论的实际应用。一般液相层析的固定相颗粒为100?m;而HPLC柱子的固定相颗粒为10?m以下，且压力可达150kg/cm。它使Rs大大提高，也使分离的效率大大提高了。

③ 采用适当的流速，也可使理论塔板的高度降低，增大理论塔板数。太高或太低的流速都是不可取的。对于一个层析柱，它有一个最佳的流速。特别是对于气相色谱，流速影响相当大。

⑵ 改变容量因子D(固定相与流动相中溶质量的分布比)。一般是加大D，但D的数值通常不超过10，再大对提高Rs不明显，反而使洗脱的时间延长，谱带加宽。一般D限制在1 ? D ? 10，最佳范围在1.5-5之间。我们可以通过改变柱温(一般降低温度)，改变流动相的性质及组成(如改变pH值，离子强度，盐浓度，有机溶剂比例等)，或改变固定相体积与流动相体积之比(如用细颗粒固定相，填充的紧密与均匀些)，提高D值，使分离度增大。

⑶ 增大?(分离因子，也称选择性因子，是两组分容量因子D之比)，使Rs变大。实际上，使 ? 增大，就是使两种组分的分配系数差值增大。同样，我们可以通过改变固定相的性质、组成，改变流动相的性质、组成，或者改变层析的温度，使 ? 发生改变。应当指出的是，温度对分辨率的影响，是对分离因子与理论塔板高度的综合效应。因为温度升高，理论塔板高度有时会降低，有时会升高，这要根据实际情况去选择。通常，? 的变化对Rs影响最明显。

总之，影响分离度或者说分离效率的因素是多方面的。我们应当根据实际情况综合考虑，特别是对于生物大分子，我们还必须考虑它的稳定性，活性等问题。如pH值、温度等都会产生较大的影响，这是生化分离绝不能忽视的。否则，我们将不能得到预期的效果。

5. 正相色谱与反相色谱

正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性，因此，在这种层析过程中非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动的速度快，先从柱中流出来。

反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子移动的速度快而先从柱中流出。

一般来说，分离纯化极性大的分子(带电离子等)采用正相色谱(或正相柱)，而分离纯化极性小的有机分子(有机酸、醇、酚等)多采用反相色谱(或反相柱)。

6. 操作容量(或交换容量)

在一定条件下，某种组分与基质(固定相)反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，我们称为操作容量(或交换容量)。它的单位是毫摩尔(或毫克)/克(基质)或毫摩尔(或毫克)/毫升(基质)，数值越大，表明基质对该物质的亲合力越强。应当注意，同一种基质对不同种类分子的操作容量是不相同的，这主要是由于分子大小(空间效应)、带电荷的多少、溶剂的性质等多种因素的影响。因此，实际操作时，加入的样品量要尽量少些，特别是生物大分子，样品的加入量更要进行控制，否则用层析办法不能得到有效的分离。

3.1.4 层析法的分类

层析根据不同的标准可以分为多种类型:

1. 根据固定相基质的形式分类，层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。纸层析是指以滤纸作为基质的层析。薄层层析是将基质在玻璃或塑料等光滑表面铺成一薄层，在薄层上进行层析。柱层析则是指将基质填装在管中形成柱形，在柱中进行层析。纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用，而柱层析是常用的层析形式，适用于样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱等都通常采用柱层析形式。

2. 根据流动相的形式分类，层析可以分为液相层析和气相层析。气相层析是指流动相为气体的层析，而液相层析指流动相为液体的层析。气相层析测定样品时需要气化，大大限制了其在生化领域的应用，主要用于氨基酸、核酸、糖类、脂肪酸等小分子的分析鉴定。而液相层析是生物领域最常用的层析形式，适于生物样品的分析、分离。

3. 根据分离的原理不同分类，层析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。

吸附层析是以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层析技术。

分配层析是根据在一个有两相同时存在的溶剂系统中，不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。

凝胶过滤层析是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的分子大小进行分离的一种层析技术。

离子交换层析是以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而进行分离的一种层析技术。

亲和层析是根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力(如酶和抑制剂、抗体和抗原、激素和受体等)，将某种配体连接在载体上作为固定相，而对能与配体特异性结合的生物大分子进行分离的一种层析技术。亲和层析是分离生物大分子最为有效的层析技术，具有很高分辨率。

3.1.5 柱层析的基本装置及基本操作

目前，最常用的层析类型是各种柱层析，下面就简述柱层析的基本装置及操作方法，薄层层析的装置和操作将在后面详细讨论。

1. 柱层析的基本装置

2. 柱层析的基本操作

柱层析的基本操作包括以下一些步骤：

⑴ 装柱

柱子装的质量好与差，是柱层析法能否成功分离纯化物质的关键步骤之一。一般要求柱子装的要均匀，不能分层，柱子中不能有气泡等。否则要重新装柱。

首先选好柱子，根据层析的基质和分离目的而定。一般柱子的直径与长度比为1:10~50;凝胶柱可以选1:100~200，同时将柱子洗涤干净。

将层析用的基质(如吸附剂、树脂、凝胶等)在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度的酸(0.5N~1N)、碱 (0.5N~1N)、盐(0.5M~1M)溶液洗涤处理，以除去其表面可能吸附的杂质。然后用去离子水(或蒸馏水)洗涤干净并真空抽气(吸附剂等与溶液混合在一起)，以除去其内部的气泡。

关闭层析柱出水口，并装入1/3柱高的缓冲液，并将处理好的吸附剂等缓慢地倒入柱中，使其沉降约3cm高。

打开出水口，控制适当流速，使吸附剂等均匀沉降，并不断加入吸附剂溶液。(吸附剂的多少根据分离样品的多少而定。)注意不能干柱、分层，否则必须重新装柱。

最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有2~3cm高的缓冲液，同时关闭出水口。(采用机械化装柱法在此省略。)

⑵ 平衡

柱子装好后，要用所需的缓冲液(有一定的pH和离子强度)平衡柱子。用恒流泵在恒定压力下走柱子(平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同)。平衡液体积一般为3~5倍柱床体积，以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。如果需要，可用兰色葡聚糖2000在恒压下走柱，如色带均匀下降，则说明柱子是均匀的。有时柱子平衡好后，还要进行转型处理。这方面的内容在离子交换层析中加以介绍。

⑶ 加样

加样量的多少直接影响分离的效果。一般讲，加样量尽量少些，分离效果比较好。通常加样量应少于20%的操作容量，体积应低于5%的床体积，对于分析性柱层析，一般不超过床体积的1%。当然，最大加样量必须在具体条件下多次试验后才能决定。

应注意的是，加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面，尽量避免冲击基质，以保持基质表面平坦。详细操作见层析实验。

⑷ 洗脱

当我们选定好洗脱液后，洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。

简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔(或洗脱体积间隔)也不长，采用这种方法是适宜的。但选择的溶剂必须很合适方能使各组分的分配系数较大。否则应采用下面的方法。

分步洗脱：这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液，进行逐级洗脱。它主要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。

梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或pH值等。最常用的是浓度梯度。在水溶液中，亦即离子强度梯度。可形成梯度的形式有三种。

洗脱条件的选择，也是影响层析效果的重要因素。当对所分离的混合物的性质了解较少时，一般先采用线性梯度洗脱的方式去尝试，但梯度的斜率要小一些，尽管洗脱时间较长，但对性质相近的组分分离更为有利。同时还应注意洗脱时的速率。前面我们已经谈到，流速的快慢将影响理论塔板高度，从而影响分辨率。事实上，速度太快，各组分在固液两相中平衡时间短，相互分不开，仍以混合组分流出。速度太慢，将增大物质的扩散，同样达不到理想的分离效果。只有多次试验才会得到合适的流速。总之，我们必须经过反复的试验与调整(可以用正交试验或优选法)，才能得到最佳的洗脱条件。还应强调的一点是，在整个洗脱过程中，千万不能干柱，否则分离纯化将会前功尽弃。

⑸ 收集、鉴定及保存

在生化实验中，基本上我们都是采用部分收集器来收集分离纯化的样品。由于检测系统的分辨率有限，洗脱峰不一定能代表一个纯净的组分。因此，每管的收集量不能太多，一般1ml-5ml / 管。如果分离的物质性质很相近，可低至0.5ml / 管。这视具体情况而定。在合并一个峰的各管溶液之前，还要进行鉴定。例如，一个蛋白峰的各管溶液，我们要先用电泳法对各管进行鉴定。对于是单条带的，认为已达电泳纯，合并在一起。其他的另行处理。对于不同种类的物质采用相应的鉴定方法，在这里不再叙述。最后，为了保持所得产品的稳定性与生物活性，我们一般采用透析除盐、超滤或减压薄膜浓缩，再冰冻干燥，得到干粉，在低温下保存备用。

⑹ 基质(吸附剂、交换树脂或凝胶等)的再生

许多基质(吸附剂、交换树脂或凝胶等)可以反复使用多次，而且价格昂贵，所以层析后要回收处理，以备再用，严禁乱倒乱扔。这也是一个科研工作者的科学作风问题。各种基质的再生方法可参阅具体层析实验及有关文献。

3.2 凝胶层析

3.2.1 简介

凝胶层析(gel chromatography)又称为凝胶排阻层析(gel exclusion chromatography)、分子筛层析(molecular sieve chromatography)、凝胶过滤(gel filtration)、凝胶渗透层析(gel permeation chromatography)等。它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。1959年，Porath和Flodin首次用一种多孔聚合物-交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不同分子量的样品，称为凝胶过滤。1964年，Moore制备了具有不同孔径的交联聚苯乙烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，称为凝胶渗透层析(流动相为有机溶剂的凝胶层析一般称为凝胶渗透层析)。随后这一技术得到不断的完善和发展，目前广泛的应用于生物化学、高分子化学等很多领域。

凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，因此广泛用于蛋白质(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。

3.2.2 凝胶层析的基本原理

凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出;而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出;而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。

1. 外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积、洗脱体积

外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。基质体积是指凝胶颗粒实际骨架体积。而柱床体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积。洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。我们设柱床体积为Vt，外水体积为Vo，内水体积为Vi，基质体积为Vg，则有：

Vt=Vo+Vi+Vg

由于Vg相对很小，可以忽略不计，则有：

Vt=Vo+Vi

设洗脱体积为Ve，Ve一般是介于Vo 和Vt之间的。对于完全排阻的大分子，由于其不进入凝胶颗粒内部，而只存在于流动相中，故其洗脱体积Ve=Vo;对于完全渗透的小分子，由于它可以存在于凝胶柱整个体积内(忽略凝胶本身体积Vg)，故其洗脱体积Ve=Vt。分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。有时可能会出现Ve ? Vt，这是由于这种分子与凝胶有吸附作用造成的。

柱床体积Vt可以通过加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的体积来测定。外水体积Vo可以通过测定完全排阻的大分子物质的洗脱体积来测定，一般常用蓝色葡聚糖-2000作为测定外水体积的物质。因为它的分子量大(为200万)，在各种型号的凝胶中都被排阻，并且它呈蓝色，易于观察和检测。

2. 分配系数

分配系数是指某个组分在固定相和流动相中的浓度比。对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系。

3. 排阻极限

排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同时被最先洗脱出来。排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离。例如Sephadex G-50的排阻极限为30,000，它表示分子量大于30,000的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗脱出来。

4. 分级分离范围

分级分离范围表示一种凝胶适用的分离范围，对于分子量在这个范围内的分子，用这种凝胶可以得到较好的线性分离。例如Sephadex G-75对球形蛋白的分级分离范围为3,000-70,000，它表示分子量在这个范围内的球形蛋白可以通过Sephadex G-75得到较好的分离。应注意，对于同一型号的凝胶，球形蛋白与线形蛋白的分级分离范围是不同的。

5. 吸水率和床体积

吸水率是指1g干的凝胶吸收水的体积或者重量，但它不包括颗粒间吸附的水份。所以它不能表示凝胶装柱后的体积。而床体积是指1g干的凝胶吸水后的最终体积。

6. 凝胶颗粒大小

层析用的凝胶一般都成球形，颗粒的大小通常以目数(mesh)或者颗粒直径(m)来表示。柱子的分辨率和流速都与凝胶颗粒大小有关。颗粒大，流速快，但分离效果差;颗粒小，分离效果较好，但流速慢。一般比较常用的是100-200目。

3.2.4 凝胶的种类和性质

凝胶的种类很多，常用的凝胶主要有葡聚糖凝胶(dextran)、聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide)、琼脂糖凝胶(agarose)以及聚丙烯酰胺和琼脂糖之间的交联物。另外还有多孔玻璃珠、多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等等。下面将分别介绍。

1. 葡聚糖凝胶

葡聚糖凝胶是指由天然高分子-葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。葡聚糖凝胶主要由Pharmacia Biotech生产。常见的有两大类，商品名分别为Sephadex和Sephacryl。

葡聚糖凝胶中最常见的是Sephadex系列，它是葡聚糖与3-氯-1,2环氧丙烷(交联剂)相互交联而成，交联度由环氧氯丙烷的百分比控制。Sephadex 的主要型号是G-10 ? G-200，后面的数字是凝胶的吸水率(单位是ml / g干胶)乘以10。如Sephadex G-50，表示吸水率是5ml/g干胶。Sephadex的亲水性很好，在水中极易膨胀，不同型号的Sephadex的吸水率不同，它们的孔穴大小和分离范围也不同。数字越大的，排阻极限越大，分离范围也越大。Sephadex中排阻极限最大的G-200为6?105。Sephadex在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液以及有机溶液中都是比较稳定的，可以多次重复使用。Sephadex稳定工作的pH一般为为2-10。强酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂，所以要避免Sephadex与强酸和氧化剂接触。Sephadex在高温下稳定，可以煮沸消毒，在100 ?C下40 min对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。Sephadex由于含有羟基基团，故呈弱酸性，这使得它有可能与分离物中的一些带电基团(尤其是碱性蛋白)发生吸附作用。但一般在离子强度大于0.05的条件下，几乎没有吸附作用。所以在用Sephadex进行凝胶层析实验时常使用一定浓度的盐溶液作为洗脱液，这样就可以避免Sephadex与蛋白发生吸附，但应注意如果盐浓度过高，会引起凝胶柱床体积发生较大的变化。Sephadex有各种颗粒大小(一般有粗、中、细、超细)可以选择，一般粗颗粒流速快，但分辨率较差;细颗粒流速慢，但分辨率高。要根据分离要求来选择颗粒大小。Sephadex的机械稳定性相对较差，它不耐压，分辨率高的细颗粒要求流速较慢，所以不能实现快速而高效的分离。

另外，Sephadex G-25和G-50中分别加入羟丙基基团反应，形成LH型烷基化葡聚糖凝胶，主要型号为Sephadex LH-20和LH-60，适用于以有机溶剂为流动相，分离脂溶性物质，例如胆固醇、脂肪酸激素等。

Sephacryl是葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺(N, N’-methylenebisacrylamide)交联而成。是一种比较新型的葡聚糖凝胶。Sephacryl的优点就是它的分离范围很大，排阻极限甚至可以达到108，远远大于Sephadex的范围。所以它不仅可以用于分离一般蛋白，也可以用于分离蛋白多糖、质粒、甚至较大的病毒颗粒。 Sephacryl与Sephadex相比另一个优点就是它的化学和机械稳定性更高：Sephacryl在各种溶剂中很少发生溶解或降解，可以用各种去污剂、胍、脲等作为洗脱液，耐高温，Sephacryl稳定工作的pH一般为

3~11。另外Sephacryl的机械性能较好，可以以较高的流速洗脱，比较耐压，分辨率也较高，所以Sephacryl相比Sephadex可以实现相对比较快速而且较高分辨率的分离。

2. 聚丙烯酰胺凝胶

聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺(acrylamide)与甲叉双丙烯酰胺交联而成。改变丙烯酰胺的浓度，就可以得到不同交联度的产物。聚丙烯酰胺凝胶主要由Bio-Rad Laboratories生产，商品名为Bio-Gel P，主要型号有Bio-Gel P-2 ? Bio-Gel P-300等10种，后面的数字基本代表它们的排阻极限的10-3，所以数字越大，可分离的分子量也就越大。各种型号的主要参数如附表所示。聚丙烯酰胺凝胶的分离范围、吸水率等性能基本近似于Sephadex。排阻极限最大的Bio-Gel P-300为4?105。聚丙烯酰胺凝胶在水溶液、一般的有机溶液、盐溶液中都比较稳定。聚丙烯酰胺凝胶在酸中的稳定性较好，在pH为1~10之间比较稳定。但在较强的碱性条件下或较高的温度下，聚丙烯酰胺凝胶易发生分解。聚丙烯酰胺凝胶非常亲水，基本不带电荷，所以吸附效应较小。另外，聚丙烯酰胺凝胶不会象葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶那样可能生长微生物。聚丙烯酰胺凝胶对芳香族、酸性、碱性化合物可能略有吸附作用，使用离子强度略高的洗脱液就可以避免。

3. 琼脂糖凝胶

琼脂糖是从琼脂中分离出来的天然线性多糖，它是琼脂去掉其中带电荷的琼脂胶得到的。琼脂糖是由D-半乳糖(D-galactose)和3,6-脱水半乳糖(anhydrogalactose)交替构成的多糖链。它在100 ?C时呈液态，当温度降至45 ?C以下时，多糖链以氢键方式相互连接形成双链单环的琼脂糖，经凝聚即成为束状的琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶的商品名因生产厂家不同而异，常见的主要有Pharmacia Biotech生产的Sepharose(2B ? 4B)和Bio-Rad Laboratories生产的Bio-gel A等。关于各种琼脂糖凝胶的基本参数如附表所示。琼脂糖凝胶在pH为4-9之间是稳定的，它在室温下很稳定，稳定性要超过一般的葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶对样品的吸附作用很小。另外琼脂糖凝胶的机械强度和孔穴的稳定性都很好，一般好于前两种凝胶，在高盐浓度下，柱床体积一般不会发生明显变化，使用琼脂糖凝胶时洗脱速度可以比较快。琼脂糖凝胶的排阻极限很大，分离范围很广，适合于分离大分子物质，但分辨率较低。琼脂糖凝胶不耐高温，使用温度以0-30 ?C为宜。

Sepharose与2,3二溴丙醇反应，形成Sepharose CL型凝胶(CL-2B ? CL-4B)，它们的分离特性基本没有改变，但热稳定性和化学稳定性都有所提高，可以在更广泛的pH范围内应用，稳定工作的pH范围为3-13。Sepharose CL型凝胶还特别适合于含有有机溶剂的分离。

4. 聚丙烯酰胺和琼脂糖交联凝胶

这类凝胶是由交联的聚丙烯酰胺和嵌入凝胶内部的琼脂糖组成。它们主要由LKB提供，商品名为Ultragel。这种凝胶由于含有聚丙烯酰胺，所以有较高分辨率;而它又含有琼脂糖，这使得它又有较高的机械稳定性，可以使用较高的洗脱速度。调整聚丙烯酰胺和琼脂糖的浓度可以使Ultragel有不同的分离范围，

5. 多孔硅胶、多孔玻璃珠

多孔硅胶和多孔玻璃珠都属于无机凝胶。顾名思义，它们就是将硅胶或玻璃制成具有一定直径的网孔状结构的球形颗粒。这类凝胶属于硬质无机凝胶，它们的最大的特点是机械强度很高、化学稳定性好，使用方便而且寿命长，无机胶一般柱效较低，但用微粒的多孔硅胶制成的HPLC柱也可以有很高的柱效，可以达到4?104塔板 / 米。多孔玻璃珠易破碎，不能填装紧密，所以柱效相对较低。多孔硅胶和多孔玻璃珠的分离范围都比较宽，多孔硅胶一般为102-5?106，多孔玻璃珠一般为3?103-9?106。它们的最大缺点是吸附效应较强(尤其是多孔硅胶)，可能会吸附比较多的蛋白，但可以通过表面处理和选择洗脱液来降低吸附。另外它们也不能用于强碱性溶液，一般使用时pH应小于8.5。

另外值得一提的是各类凝胶技术近年来发展得很快，目前已研制出很多性能优越的新型凝胶。例如Pharmacia Biotech的Superdex和Superrose，Superdex的分辨率非常高，化学物理稳定性也很好，可以用于FPLC、HPLC分析;而Superose的分离范围很广，分辨率较高，可以一次性的分离分子量差异较大的混合物。同时它的机械稳定性也很好。关于各种凝胶产品的详细情况可以参阅本书附录以及各个公司的产品目录。

3.2.5 凝胶的选择、处理和保存

1. 凝胶的选择

通过前面的介绍可以看到凝胶的种类、型号很多。不同类型的凝胶在性质以及分离范围上都有较大的差别，所以在进行凝胶层析实验时要根据样品的性质以及分离的要求选择合适的凝胶，这是影响凝胶层析效果好坏的一个关键因素。

一般来讲，选择凝胶首先要根据样品的情况确定一个合适的分离范围，根据分离范围来选择合适型号的凝胶。一般的凝胶层析实验可以分为两类：分组分离(group separations)和分级分离(fractionations)，分组分离是指将样品混合物按分子量大小分成两组，一组分子量较大，另一组分子量较小。例如蛋白样品的脱盐或蛋白、核酸溶液去除小分子杂质以及一些注射剂去除大分子热源物质等等。分级分离则是指将一组分子量比较接近的组分分开。在分组分离时要选择能将大分子完全排阻而小分子完全渗透的凝胶，这样分离效果好。一般常用排阻极限较小的凝胶类型。分级分离时则要根据样品组分的具体情况来选择凝胶的类型，凝胶的分离范围一方面应包括所要的各个组分的分子量，另一方面要合适，不能过大。如果分离范围选择过小，则某些组分不能得到分离;如分离范围选择过大，则分辨率较低，分离效果也不好。

选择凝胶另外一个方面就是凝胶颗粒的大小。颗粒小，分辨率高，但相对流速慢，实验时间长，有时会造成扩散现象严重;颗粒大，流速快，分辨率较低但条件得当也可以得到满意的结果。选择时要依据分离的具体情况而定，例如样品中各个组分差别较大，则可以选用大颗粒的凝胶，这样可以很快的达到分离的目的;如果有个别组分差别较小，则要考虑使用小颗粒凝胶以提高分辨率。由于凝胶一般都比较稳定，所以它在一般的实验条件下都可以正常的工作。如果实验条件比较特殊，如在较强的酸碱中进行或含有有机溶剂等等，则要仔细查看凝胶的工作参数，选择合适的类型的凝胶。

2. 凝胶的处理

凝胶使用前要首先要进行处理。选择好凝胶的类型后，首先要根据选择的层析柱估算出凝胶的用量。由于市售的葡聚糖凝胶和丙烯酰胺凝胶通常是无水的干胶，所以要计算干胶用量：干胶用量(g)=柱床体积(ml)/ 凝胶的床体积(ml / g)。 由于凝胶处理过程以及实验过程可能有一定损失，所以一般凝胶用量在计算的基础上再增加10%-20%。

葡聚糖凝胶和丙烯酰胺凝胶干胶的处理首先是在水中膨化，不同类型的凝胶所需的膨化时间不同。一般吸水率较小的凝胶(即型号较小、排阻极限较小的凝胶)膨化时间较短，在20 ?C条件下需3-4小时;但吸水率较大的凝胶(即型号较大、排阻极限较大的凝胶)膨化时间则较长，20 ?C条件下需十几个到几十个小时，如Sephadex G-100以上的干胶膨化时间都要在72小时以上。如果加热煮沸，则膨化时间会大大缩短，一般在1-5小时即可完成，而且煮沸也可以去除凝胶颗粒中的气泡。但应注意尽量避免在酸或碱中加热，以免凝胶被破坏。琼脂糖凝胶和有些市售凝胶是水悬浮的状态，所以不需膨化处理。另外多孔玻璃珠和多孔硅胶也不需膨化处理。

膨化处理后，要对凝胶进行纯化和排除气泡。纯化可以反复漂洗，倾泻去除表面的杂质和不均一的细小凝胶颗粒。也可以一定的酸或碱浸泡一段时间，再用水洗至中性。排除凝胶中的气泡是很重要的，否则会影响分离效果，可以通过抽气或加热煮沸的方法排除气泡。

3. 凝胶的保存

凝胶的保存一般是反复洗涤去除蛋白等杂质，然后加入适当的抗菌剂，通常加入0.02%的叠氮化钠，4 ?C下保存。如果要较长时间的保存，则要将凝胶洗涤后脱水、干燥，可以将凝胶过滤抽干后浸泡在50%的乙醇中脱水，抽干后再逐步提高乙醇浓度反复浸泡脱水，至95%乙醇脱水后将凝胶抽干。置于60 ?C烘箱中烘干，即可装瓶保存。注意膨化的凝胶不能直接高温烘干，否则可能会破坏凝胶的结构。

3.2.6 凝胶层析的基本操作

凝胶层析的基本操作步骤与前面介绍的柱层析的操作过程基本相似，这里就不再重复了。下面主要介绍凝胶层析操作中应注意的一些具体问题。

1. 层析柱的选择

层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高;但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。一般柱长度不超过100cm，为得到高分辨率，可以将柱子串联使用。层析柱的直径和长度比一般在1:25-1:100之间。用于分组分离的凝胶柱，如脱盐柱由于对分辨率要求较低，所以一般比较短。

2. 凝胶柱的鉴定

凝胶柱的填装情况将直接影响分离效果，关于填装的方法前面已有介绍，这里主要介绍对填装好的凝胶柱的鉴定。凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。另外通常可以采用一种有色的物质，如蓝色葡聚糖-2000、血红蛋白等上柱，观察有色区带在柱中的洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度。如果色带狭窄、平整、均匀下降，则表明柱中的凝胶填装情况较好，可以使用;如果色带弥散、歪曲，则需重新装柱。另外值得一提的是，有时为了防止新凝胶柱对样品的吸附，可以用一些物质预先过柱，以消除吸附。

3. 洗脱液的选择

由于凝胶层析的分离原理是分子筛作用，它不象其它层析分离方式主要依赖于溶剂强度和选择性的改变来进行分离，在凝胶层析中流动相只是起运载工具的作用，一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高分辨率，改变洗脱液的主要目的是为了消除组分与固定相的吸附等相互作用，所以和其它层析方法相比，凝胶层析洗脱液的选择不那么严格。由于凝胶层析的分离机理简单以及凝胶稳定工作的pH范围较广，所以洗脱液的选择主要取决于待分离样品，一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析。为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓度的盐。

4. 加样量

关于加样前面已经有所介绍，要尽量快速、均匀。另外加样量对实验结果也可能造成较大的影响，加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果;加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。加样量的多少要根据具体的实验要求而定：凝胶柱较大，当然加样量就可以较大;样品中各组分分子量差异较大，加样量也可以较大;一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1%-5%左右，而分组分离时加样体积可以较大，一般约为凝胶柱床体积的10%-25%。如果有条件可以首先以较小的加样量先进行一次分析，根据洗脱峰的情况来选择合适的加样量。设要分离的两个组分的洗脱体积分别为Ve1和Ve2，那么加样量不能超过(Ve1-Ve2)。实际由于样品扩散，所以加样量应小于这个值。从洗脱峰上看，如果所要的各个组分的洗脱峰分得很开，为了提高效率，可以适当增加加样量;如果各个组分的洗脱峰只是刚好分开或没有完全分开，则不能再加大加样量，甚至要减小加样量。另外加样前要注意，样品中的不溶物必须在上样前去掉，以免污染凝胶柱。样品的粘度不能过大，否则会影响分离效果。

5. 洗脱速度

洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果，一般洗脱速度要恒定而且合适。保持洗脱速度恒定通常有两种方法，一种是使用恒流泵，另一种是恒压重力洗脱。洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等，一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽，反而会降低分辨率，而且实验时间会大大延长;所以实验中应根据实际情况来选择合适的洗脱速度，可以通过进行预备实验来选择洗脱速度。一般凝胶的流速是2-10 cm / hr，市售的凝胶一般会提供一个建议流速，可供参考。

总之，凝胶层析的各种条件，包括凝胶类型、层析柱大小、洗脱液、上样量、洗脱速度等等，都要根据具体的实验要求来选择。例如样品中各个组分差异较小，则实验要求凝胶层析要有较高的分辨率，提高分辨率的选择应主要包括：选择包括各个待分离组分但分离范围尽量小一些的凝胶，选择颗粒小的凝胶，选择分辨率高的凝胶类型，选择较长、直径较大的层析柱、减少加样量、降低洗脱速度等等。但正如前面讲过的，各种选择都有一个限度的问题，超过这个限度可能会产生相反的效果。另外需要提的一点是，实验时应尽可能的参考相关实验和文献以及进行预实验，以选择最合适的实验条件。

3.2.7 凝胶层析的应用

前面介绍了凝胶层析的基本理论以及基本实验操作，下面简单介绍一下凝胶层析在生物学方面的应用。

1. 生物大分子的纯化

凝胶层析是依据分子量的不同来进行分离的，由于它的这一分离特性，以及它具有简单、方便、不改变样品生物学活性等优点，使得凝胶层析成为分离纯化生物大分子的一种重要手段，尤其是对于一些大小不同，但理化性质相似的分子，用其它方法较难分开，而凝胶层析无疑是一种合适的方法。例如对于不同聚合程度的多聚体的分离等。

2. 分子量测定

前面已经介绍了，在一定的范围内，各个组分的Kav以及Ve与其分子量的对数成线性关系。

Kav=-b lg MW+c

Ve=-b’ lg MW+c’

由此通过对已知分子量的标准物质进行洗脱，作出Ve或Kav对分子量对数的标准曲线，然后在相同的条件下测定未知物的Ve或Kav，通过标准曲线即可求出其分子量。凝胶层析测定分子量操作比较简单，所需样品量也较少，是一种初步测定蛋白分子量的有效方法。这种方法的缺点是测量结果的准确性受很多因素影响。由于这种方法假定标准物和样品与凝胶都没有吸附作用，所以如果标准物或样品与凝胶有一定的吸附作用，那么测量的误差就会比较大;上面公式成立的条件是蛋白基本是球形的，对于一些纤维蛋白等细长的形状的蛋白不成立，所以凝胶层析不能用于测定这类分子的分子量;另外由于糖的水合作用较强，所以用凝胶层析测定糖蛋白时，测定的分子量偏大，而测定铁蛋白时则发现测定值偏小;还要注意的是标准蛋白和所测定的蛋白都要在凝胶层析的线性范围之内。

3. 脱盐及去除小分子杂质

利用凝胶层析进行脱盐及去除小分子杂质是一种简便、有效、快速的方法，它比一般用透析的方法脱盐要快得多，而且一般不会造成样品较大的稀释，生物分子不易变性。一般常用的是Sephadex G-25，另外还有Bio-Gel P-6 DG或Ultragel AcA 202等排阻极限较小的凝胶类型。目前已有多种脱盐柱成品出售，使用方便，但价格较贵。

4. 去热源物质

热源物质是指微生物产生的某些多糖蛋白复合物等使人体发热的物质。它们是一类分子量很大的物质，所以可以利用凝胶层析的排阻效应将这些大分子热源物质与其它相对分子量较小的物质分开。例如对于去除水、氨基酸、一些注射液中的热源物质，凝胶层析是一种简单而有效的方法。

5. 溶液的浓缩

利用凝胶颗粒的吸水性可以对大分子样品溶液进行浓缩。例如将干燥的Sephadex(粗颗粒)加入溶液中，Sephadex可以吸收大量的水，溶液中的小分子物质也会渗透进入凝胶孔穴内部，而大分子物质则被排阻在外。通过离心或过滤去除凝胶颗粒，即可得到浓缩的样品溶液。这种浓缩方法基本不改变溶液的离子强度和pH值